ta a diversas especies de la fauna silvestre como zorros, mapaches, lobos; a especies de interés ganadero como bovinos, cerdos, equinos; especies de zonas urbanas como perros, gatos y también al humano. Una vez adquirida es mortal, se puede prevenir mediante la administración de vacunas que contienen cepas virales atenuadas o inactivas que se aplican en especies animales expuestas frecuentemente al virus o a personas de grupos de riesgo como guardabosques, veterinarios y personales de laboratorio que maneja los virus( Rupercht y Plotkin, 2013).
El género Brucella incluye bacterias Gram negativas que son naturalmente intracelulares y producen Brucelosis en diferentes especies como ovinos, bovinos, caprinos e incluso el humano. Su principal medida de prevención y control es la vacunación, donde se utilizan cepas atenuadas que se administran a una especie animal en particular; para el caso de Brucelosis bovina( BB), se cuenta con dos cepas vacunales de Brucella abortus, la cepa S19 y la cepa RB51. La cepa Brucella abortus S19 es la cepa vacunal más eficiente para proteger contra BB; por otro lado la cepa RB51 tiene una eficiencia controversial y su administración se recomienda en zonas libres de BB( Altun, Junes, Angus y Verger, 1988). Brucella canis virB10 es una cepa recombinante creada para la protección de brucelosis canina.
Los bovinos y los perros son afectados por Brucelosis y Rabia y aunque ya se cuenta con vacunas para protegerlos contra ambas enfermedades es importante buscar nuevas alternativas para mejorar la prevención y control en las especies animales, lo cual impactaría favorablemente en la Brucelosis humana.
La naturaleza intracelular de las especies de Brucella y la condición atenuada de las cepas vacunales anteriormente mencionadas las presenta como un alternativa para emplearlas como vectores para entregar plásmidos vacunales antirrábicos; por ello, el objetivo de este trabajo es transformar cepas atenuadas del género Brucella con un plásmido vacunal antirrábico para evaluar su utilidad como vector, y llegar a desarrollar un producto que potencialmente se emplee como vacuna contra Brucelosis y Rabia en especies animales.
Metodología y resultados
Purificación del plásmido vacunal antirrábico. El plásmido pBBR4- CMV-Ggp-SV40 + se purificó a partir de un cultivo continuo de la cepa E. coli TOP 10 crecida en Caldo Soya Tripticaseína – ampicilina( CST-Amp) y se obtuvo en una concentración de 2.85 µ g /µ l.
Cepas bacterianas. Se emplearon las cepas vacunales de Brucella abortus S19, Brucella abortus RB51, Brucella canis virB10. Todas las cepas se cultivaron en Caldo Soya Tripticaseína( CST)/ 37 oC / 200 rpm, o Agar Soya Tripticaseína( AST) según los requerimientos de trabajo. Después de la transformación, las cepas de Brucella portadoras del plásmido se propagaron en AST o CST conteniendo ampicilina( 100 mg / ml).
Transformación de cepas vacunales Todas las cepa se transformaron por electroporación empleando 3 μg del plásmido pBBR4-CMV-Ggp- SV40 + puro; para ello, se prepararon células electrocompetentes de cada cepa y se procesaron en el electroporador, aplicando un pulso de 2.5 Kv. Las colonias ampr se recuperaron en AST-Amp para su posterior identificación( Figura 2).
Figura 2. Recuperación de cepas atenuadas transformadas con el plásmido vacunal antirrábico pBBR4-CMV-Ggp-SV40 + en AST-Amp.
Identificación de cepas portadoras del plásmido vacunal antirrábico. Colonias candidato de las cepas transformantes portadoras del plásmido se identificaron mediante Reacción en cadena de la Polimerasa( PCR, por sus siglas en Inglés) empleando los iniciadores Gli1 y Gli2 específicos para amplificar un fragmento de 736 pb del gen de la gpG. La secuencia de los iniciadores fue: sentido 5’-ACACAATCCGTACCCTGACT-3’ y antisentido 5’-CCCGTTTACATGAGGATGAC-3’, aplicando el siguiente protocolo de amplificación: desnaturalización inicial a 96 ° C por 1min, 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C por 30 seg, alineamiento a 64 ° C por 45 seg, extensión a 72 ° C por 1 min, con una incubación final a 72 ° C por 10 min. Los productos de amplificación se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa( EGA) al 1 %, las condiciones de corrimiento fueron 80 V / 1 h( Figura 3), como control positivo de identificación del plásmido se usó la cepa de E. coli TOP-10 y como control negativo las cepas vacunales sin transformación. La PCR certificó las cepas vacunales exitosamente transformadas que se mantuvieron en congelación en CST con glicerol al 10 % a-70 o C.
126
Revista Científica