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Kit para decorionação de embriões de peixe-zebra( Danio rerio) utilizando peptidases do látex de Calotropis procera

em espectrofotômetro. Nessa condição, o substrato é degradado pelas peptidases, ocorrendo a liberação da caseína, e a porção“ azo” passa a funcionar como cromóforo neste comprimento de onda.

Outro ensaio foi feito combinando 30 µ L da solução de peptidases, na concentração de 2 mg / mL, com 30 µ L de uma solução de cloridrato de cisteína anidra, na concentração 0,5 mM, com incubação de 10 minutos a 25 ° C, para que as peptidases fossem ativadas. Após a ativação das peptidases, 100 µ L da azocaseína a 2 % foi adicionada à mistura, que foi incubada por 60 minutos. Ao final desse tempo, 160 µ L de TCA 10 % foi adicionado, com agitação suave, com incubação de 10 minutos. A mistura foi centrifugada, o sobrenadante foi recolhido, onde sobre ele foi adicionado o NaOH, e em seguida foi feita a leitura no espectrofotômetro na faixa de 450 nm, como referido anteriormente. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de promover uma mudança de 0,01 na absorbância por minuto. Matematicamente, a atividade enzimática total pode ser representada por:

Ativ. Enzimática( U / min)= Abs. da amostra − Abs. do controle

× 100( 1)

Tempo da reação em min.

Os resultados mostraram que a absorbância da Pronase ® foi de 1,031 e conforme aplicação da Equação 1, a atividade enzimática total dessa protease foi bem significativa, com valor de 1,0131 U / min. Já as frações P5 e P6, sem a presença do aminoácido cisteína, tiveram baixa absorbância, e consequentemente, uma baixa atividade proteolítica com valores de 0,025 e 0,012, respectivamente. Ao adicionar cisteína à reação enzimática, os valores de atividade das peptidases, foram bem próximos aos encontrados para a pronase, como mostra a Tabela 1.

Tabela 1. Atividade proteolítica total da Pronase ® e das frações proteicas P5 e P6 do látex de C. procera ricas em peptidases cisteínicas, utilizando azocaseína como substrato com tempo de incubação de 60 minutos.

Amostra

Absorbância( 450 nm)

Ativ. Enzimática( U / min) *

Esses resultados confirmaram que as amostras de peptidases cedidas para estudo estavam proteoliticamente ativas e que a atividade catalítica é dependente da presença de um agente redutor no meio.

Teste de decorionação de embriões de peixezebra

Os testes para decorionação dos embriões de peixe-zebra foram feitos utilizando embriões com até 6 hpf, solução de Pronase ® em água artificial, 1 mg / mL, e

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