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Kit para decorionação de embriões de peixe-zebra ( Danio rerio ) utilizando peptidases do látex de Calotropis procera

em espectrofotômetro . Nessa condição , o substrato é degradado pelas peptidases , ocorrendo a liberação da caseína , e a porção “ azo ” passa a funcionar como cromóforo neste comprimento de onda .

Outro ensaio foi feito combinando 30 µ L da solução de peptidases , na concentração de 2 mg / mL , com 30 µ L de uma solução de cloridrato de cisteína anidra , na concentração 0,5 mM , com incubação de 10 minutos a 25 ° C , para que as peptidases fossem ativadas . Após a ativação das peptidases , 100 µ L da azocaseína a 2 % foi adicionada à mistura , que foi incubada por 60 minutos . Ao final desse tempo , 160 µ L de TCA 10 % foi adicionado , com agitação suave , com incubação de 10 minutos . A mistura foi centrifugada , o sobrenadante foi recolhido , onde sobre ele foi adicionado o NaOH , e em seguida foi feita a leitura no espectrofotômetro na faixa de 450 nm , como referido anteriormente . Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de promover uma mudança de 0,01 na absorbância por minuto . Matematicamente , a atividade enzimática total pode ser representada por :

Ativ . Enzimática ( U / min )= Abs . da amostra − Abs . do controle

× 100 ( 1 )

Tempo da reação em min .

Os resultados mostraram que a absorbância da Pronase ® foi de 1,031 e conforme aplicação da Equação 1 , a atividade enzimática total dessa protease foi bem significativa , com valor de 1,0131 U / min . Já as frações P5 e P6 , sem a presença do aminoácido cisteína , tiveram baixa absorbância , e consequentemente , uma baixa atividade proteolítica com valores de 0,025 e 0,012 , respectivamente . Ao adicionar cisteína à reação enzimática , os valores de atividade das peptidases , foram bem próximos aos encontrados para a pronase , como mostra a Tabela 1 .

Tabela 1 . Atividade proteolítica total da Pronase ® e das frações proteicas P5 e P6 do látex de C . procera ricas em peptidases cisteínicas , utilizando azocaseína como substrato com tempo de incubação de 60 minutos .

Amostra

Absorbância ( 450 nm )

Ativ . Enzimática ( U / min ) *

Esses resultados confirmaram que as amostras de peptidases cedidas para estudo estavam proteoliticamente ativas e que a atividade catalítica é dependente da presença de um agente redutor no meio .

Teste de decorionação de embriões de peixezebra

Os testes para decorionação dos embriões de peixe-zebra foram feitos utilizando embriões com até 6 hpf , solução de Pronase ® em água artificial , 1 mg / mL , e

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