Kit para decorionação de embriões de peixe-zebra (Danio rerio)
utilizando peptidases do látex de Calotropis procera
Figura 1. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% em condições desnaturantes (SDS-
PAGE) de frações proteicas (P5 e P6) do látex da C. procera. Marcadores: fosforilase B (97,0
kDa), albumina sérica bovina (66,0 kDa), anidrase carbônica (30,0 kDa), inibidor de tripsina
(20,1 kDa) e alfa-lactalbumina (14,4 kDa).
Fonte: Elaborado pela autora
Atividade proteolítica total
A fim de confirmar que as amostras
P5 e P6 fornecidas para os testes estavam
ativas foi avaliada a atividade proteolítica
total dessas peptidases, utilizando o
substrato não específico azocaseína. Para fins
comparativos, durante todos os ensaios foi
utilizada Pronase®, uma mistura complexa
de proteases rotineiramente utilizada para
decorionação de embriões de peixe-zebra.
As frações proteicas obtidas do látex da C.
procera foram testadas com e sem a presença
de L-cisteína, um agente redutor que atua
na ativação das peptidases. A atividade
proteolítica total de P5, P6 e da amostra
de Pronase® foi avaliada de acordo com a
metodologia descrita por Ramos et al. (2013),
com algumas modificações.
A reação consistiu, inicialmente, no
preparo de duas soluções de azocaseína a
2% com ajuste de pH em 7,5, utilizando água
artificial (CaCl 2 , MgSO 4 , NaHCO 3 e KCl em
água destilada) e tampão Tris- HCl 50 mM/
pH 6,5, que foram os meios para solubilização
da Pronase® e das peptidases, durante a
decorionação do embrião, respectivamente.
60
Série Iniciados v. 23
Posteriormente, foram feitas duas misturas
de reação, que continham 50 µL de azocaseína
2% e 30 µL da solução enzimática, em
temperatura de 25°C por um período de tempo
de 60 minutos. A primeira mistura de reação
foi feita pela combinação da azocaseína com
uma solução de Pronase® em água artificial
na concentração de 1 mg/mL, enquanto que,
a segunda mistura foi feita pela combinação
das frações das proteínas (P5 e P6) em
tampão Tris, na concentração de 2 mg/mL,
com a azocaseína a 2%. Paralelamente, foi
feito o controle negativo, que foi dado pela
mistura de 50 µL da enzima em 30 µL de água
artificial ou de tampão Tris. Ao final dos 60
minutos, foram adicionados, a cada mistura
reacional, 240 µL de ácido tricloroacético
(TCA) 10% durante 10 minutos. Decorrido
esse tempo, as misturas foram centrifugadas
com rotação 9.000 x g, durante 10 minutos.
Foram recolhidos 70 µL do sobrenadante,
que foram adicionados à microplaca de 96
poços. Nos poços em que havia sobrenadante,
foram adicionados 130 µL de NaOH 1M
para que a cor fosse revelada. A absorção
de luz então foi medida na faixa de 450 nm