Kit para decorionação de embriões de peixe-zebra ( Danio rerio ) utilizando peptidases do látex de Calotropis procera
os procedimentos realizados com embriões e adultos de peixe-zebra foram autorizados pela CEUA-UFPB ( Protocolo N º 048 / 2016 ).
Reagentes
Acrilamida , Coomassie Brilliant Blue R-250 , Dodecil Sulfato de Sódio ( SDS ), TEMED ( N ´, N ’, N ’, N ’ - tetrametiletilenodiamina ), trizma-base , metilenobisacrilamida e 2-mercaptoetanol foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co . ( St . Louis , EUA ). Marcador de massa molecular foi adquirido da GE Healthcare ( Invitrogen , Carlsbad , CA , EUA ). Pronase ® ( Protease de Streptomyces griseus ) também foi adquirida da Sigma-Aldrich Co . Cisteína Cloridrato Anidra adquirida da Via Farma ( São Paulo , Brasil ). Ácido clorídrico ( HCl ), cloreto de cálcio ( CaCl 2
), sulfato de magnésio ( MgSO 4 ), bicarbonato de sódio ( NaHCO 3
), cloreto de potássio ( KCl ), azocaseína , ácido tricloroacético ( TCA ), hidróxido de sódio ( NaOH ) e demais reagentes utilizados foram todos de grau analítico .
Material vegetal
Dez miligramas de duas frações de peptidases ( P5 e P6 ) obtidas do látex de C . procera , na forma liofilizada , foram cedidos pelo Laboratório de Plantas Laticíferas da Universidade Federal do Ceará ( Fortaleza , Ceará ), coordenado pelos Profs . Márcio Viana Ramos e Cleverson Diniz Teixeira . As amostras de peptidases foram armazenadas protegidas da luz , em ambiente arejado e mantidas a temperatura ambiente ( 25 º C ) até o momento dos ensaios . azul de bromofenol e 2-mercaptoetanol ) de forma a conter 2 mg / mL . Posteriormente , as amostras foram aquecidas a 100 ° C , durante 10 min , e centrifugadas a 10.000 x g , durante 5 min , a 4 ° C ( Hettich , modelo Rotina 380 R , Kirchlengern , Alemanha ). Em seguida , alíquotas de 20 e 10 µ L da amostra foram aplicados em poços feitos em um gel vertical de 1 mm de espessura , composto por géis de aplicação e separação que encerravam 5 % e 12,5 % de acrilamida , respectivamente . A corrida foi conduzida a uma corrente constante de 20 mA por placa , durante 1,5 h . As bandas proteicas foram coradas com solução de coomassie brilliant blue R-250 0,05 %. A descoloração foi feita com solução de metanol , ácido acético glacial e água ( 1 : 3,5 : 8 , v / v / v , respectivamente ). Foram utilizados marcadores de massa molecular , para que fossem estimadas as massas moleculares das proteínas analisadas . Dentre esses marcadores estão : fosforilase B ( 97,0 kDa ), albumina sérica bovina ( 66,0 kDa ), anidrase carbônica ( 30,0 kDa ), inibidor de tripsina ( 20,1 kDa ) e alfa-lactalbumina ( 14,4 kDa ).
A partir do perfil eletroforético obtido , observou-se que as bandas proteicas se apresentaram na faixa de 30 a 66 kDa ( Figura 1 ), o que está de acordo com o relatado previamente por RAMOS et al ., 2013 .
Eletroforese em gel de poliacrilamida
Para confirmar a identidade das duas amostras de peptidases do látex de C . procera fornecidas para testes , foi realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes ( presença de SDS ) de acordo com o procedimento descrito por Laemmli ( 1970 ). De forma geral , a amostra foi solubilizada em tampão de amostra ( Tris- HCl 0,0625 M , pH 6,8 com SDS 2 %, glicerol ,
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