Kit para decorionação de embriões de peixe-zebra( Danio rerio) utilizando peptidases do látex de Calotropis procera
os procedimentos realizados com embriões e adultos de peixe-zebra foram autorizados pela CEUA-UFPB( Protocolo N º 048 / 2016).
Reagentes
Acrilamida, Coomassie Brilliant Blue R-250, Dodecil Sulfato de Sódio( SDS), TEMED( N ´, N’, N’, N’- tetrametiletilenodiamina), trizma-base, metilenobisacrilamida e 2-mercaptoetanol foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co.( St. Louis, EUA). Marcador de massa molecular foi adquirido da GE Healthcare( Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Pronase ®( Protease de Streptomyces griseus) também foi adquirida da Sigma-Aldrich Co. Cisteína Cloridrato Anidra adquirida da Via Farma( São Paulo, Brasil). Ácido clorídrico( HCl), cloreto de cálcio( CaCl 2
), sulfato de magnésio( MgSO 4), bicarbonato de sódio( NaHCO 3
), cloreto de potássio( KCl), azocaseína, ácido tricloroacético( TCA), hidróxido de sódio( NaOH) e demais reagentes utilizados foram todos de grau analítico.
Material vegetal
Dez miligramas de duas frações de peptidases( P5 e P6) obtidas do látex de C. procera, na forma liofilizada, foram cedidos pelo Laboratório de Plantas Laticíferas da Universidade Federal do Ceará( Fortaleza, Ceará), coordenado pelos Profs. Márcio Viana Ramos e Cleverson Diniz Teixeira. As amostras de peptidases foram armazenadas protegidas da luz, em ambiente arejado e mantidas a temperatura ambiente( 25 º C) até o momento dos ensaios. azul de bromofenol e 2-mercaptoetanol) de forma a conter 2 mg / mL. Posteriormente, as amostras foram aquecidas a 100 ° C, durante 10 min, e centrifugadas a 10.000 x g, durante 5 min, a 4 ° C( Hettich, modelo Rotina 380 R, Kirchlengern, Alemanha). Em seguida, alíquotas de 20 e 10 µ L da amostra foram aplicados em poços feitos em um gel vertical de 1 mm de espessura, composto por géis de aplicação e separação que encerravam 5 % e 12,5 % de acrilamida, respectivamente. A corrida foi conduzida a uma corrente constante de 20 mA por placa, durante 1,5 h. As bandas proteicas foram coradas com solução de coomassie brilliant blue R-250 0,05 %. A descoloração foi feita com solução de metanol, ácido acético glacial e água( 1: 3,5: 8, v / v / v, respectivamente). Foram utilizados marcadores de massa molecular, para que fossem estimadas as massas moleculares das proteínas analisadas. Dentre esses marcadores estão: fosforilase B( 97,0 kDa), albumina sérica bovina( 66,0 kDa), anidrase carbônica( 30,0 kDa), inibidor de tripsina( 20,1 kDa) e alfa-lactalbumina( 14,4 kDa).
A partir do perfil eletroforético obtido, observou-se que as bandas proteicas se apresentaram na faixa de 30 a 66 kDa( Figura 1), o que está de acordo com o relatado previamente por RAMOS et al., 2013.
Eletroforese em gel de poliacrilamida
Para confirmar a identidade das duas amostras de peptidases do látex de C. procera fornecidas para testes, foi realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes( presença de SDS) de acordo com o procedimento descrito por Laemmli( 1970). De forma geral, a amostra foi solubilizada em tampão de amostra( Tris- HCl 0,0625 M, pH 6,8 com SDS 2 %, glicerol,
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