Kit para decorionação de embriões de peixe-zebra (Danio rerio)
utilizando peptidases do látex de Calotropis procera
soluções de peptidases P5 e P6 em tampão
Tris, 2 mg/mL, com e sem a presença de
cisteína como ativador na solução. Os
testes com as soluções de Pronase® e das
peptidases foram realizados em triplicata e os
resultados foram classificados de acordo com
a observação e categorização dos embriões
da seguinte forma: embriões com córion;
embriões decorionados viáveis e embriões
decorionados inviáveis.
Em cada teste, 12 embriões foram
coletados com o mínimo volume de água
possível, e colocados em contato com 1 mL
de cada solução durante um tempo total de
10 minutos para a solução de Pronase® e 20
minutos para as soluções de peptidases.
No teste com a pronase, os embriões
foram deixados em repouso durante 7
minutos, e ao final deste tempo, a solução em
que estavam submersos foi levemente agitada
através de 10 sucções com pipeta Pasteur. Ao
final dos 10 minutos, novamente foram feitas
10 sucções e em seguida, os embriões foram
lavados com água artificial, com o intuito de
remover resíduos de Pronase®. Foram feitas
5 lavagens, cada uma com aproximadamente,
5 mL de água artificial.
Nos testes com as peptidases, tanto
na forma ativada, quanto na forma inativada,
esperou-se o tempo de 20 minutos, dentro os
quais os 7 minutos iniciais foram de repouso,
e a agitação, através de 10 sucções, feitas em
7, 10, 13, 17 e 20 minutos. Por fim, os embriões
foram lavados com a própria água do sistema
e observados em um estereomicroscópio,
num aumento mínimo de 80x, para serem
classificados como descrito acima.
A remoção do córion dos embriões com
até 6 hpf utilizando a Pronase® foi efetiva,
conforme já relatado na literatura (HENN e
BRAUNBECK, 2011) (Tabela 2). No entanto,
além de muito custosa financeiramente,
a utilização de Pronase® mostrou-se
muito ineficiente para decorionação, pois
causou alta taxa de mortalidade e uma baixa
reprodutibilidade do método. Após 10 minutos
de exposição, o percentual de embriões
decorionados e viáveis, ou seja, aptos para
uso posterior, oscilou de 33,3 a 58,3%. Os
outros embriões apresentaram algum dano
ou então não foram decorionados.
Tabela 2. Decorionação de embriões de peixe-zebra utilizando Pronase®
Embriões decorionados
Embriões com córion
Teste 1 Teste 2 Teste 3
Viáveis 7 6 4
Inviáveis 2 3 3
Viáveis/Inviáveis 3 3 5
Total 12 12 12
Fonte: Elaborado pela autora.
Apesar das frações P5 e P6 contendo
peptidases
cisteínicas
ativadas
terem
apresentado atividade proteolítica total
equivalente àquela da Pronase®, essas
amostras não foram eficientes em promover
a decorionação de embriões de peixe-zebra.
Mesmo após 20 minutos de exposição à P5
e P6 e ainda com o auxílio mecânico das
sucções com pipeta Pasteur, os córions
dos embriões permaneceram intactos. A
principal explicação pode residir na própria
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Série Iniciados v. 23
especificidade das peptidases de P5 e P6, que
são classificadas como do tipo cisteínica por
possuírem cisteína e histidina em seu sítio
ativo. Possivelmente, o córion de embriões
de peixe-zebra não apresenta pontos de
clivagem específicos (os aminoácidos) para
que as peptidases cisteínicas consigam
hidrolisar as ligações peptídicas e, assim,
romper esse envoltório. Essa hipótese é
reforçada pelo o fato de que já é relatado que
peptidases do tipo serínicas (e.g. tripsina)