Avaliação dos efeitos da proteína antifúngica de Moringa oleifera, Mo-CBP3, sobre embriões de peixe-zebra (Danio rerio)
Teste de toxicidade aguda em embriões de
peixe-zebra (D. rerio)
O teste FET com a proteína Mo-CBP 3
foi realizado de acordo com o protocolo nº 236
da OECD (2013). Primeiramente, uma placa
de microtitulação de 24 poços foi preenchida
com 2 mL de solução teste ou controle/poço,
sendo 20 poços destinados a amostra teste e
os 4 remanescentes ao controle interno. Dessa
forma, 20 embriões de peixe-zebra com < 6
hpf (horas pós-fertilização) foram expostos
a concentração inicial padrão do teste de 100
mg/L de Mo-CBP 3 e 4 embriões mantidos
somente em água do aquário (Figura 2). Foi
preparada uma microplaca controle com
todos os embriões expostos somente à água
do aquário. O teste foi iniciado em até 6 h
após a fertilização do ovo e foi continuado até
completar 96 h. No embrião foram verificados
os seguintes pontos-finais de letalidade: (i)
coagulação do ovo; (ii) ausência de formação
do somito; (iii) não deslocamento da base da
cauda; e, (iv) falta de batimentos cardíacos.
As observações foram feitas utilizando um
estereomicroscópio, num aumento de 80X.
Figura 2. Modelo de microplaca utilizada durante o teste; os poços marcados com o número 1
foram preenchidos com uma determinada concentração da proteína teste e iC foram utilizados
como controle interno preenchidos com água do sistema de manutenção dos peixes.
Fonte: OECD Publishing, 2013.
Com base nos resultados desse
primeiro teste, denominado de teste limite,
foram executadas novas exposições com
diferentes concentrações, o chamado teste
de concentrações, que variaram de 0,04 a 20
mg/L. As condições da exposição e os sinais de
letalidade foram os mesmos descritos acima.
A realização dessas diferentes exposições teve
por objetivo encontrar concentrações que
causassem aproximadamente 0, 50 e 100%
de mortalidade dos embriões para posterior
cálculo da concentração letal para 50% dos
indivíduos (CL 50 ) após 96 h de exposição. A
partir dos números de mortos computados
50
Série Iniciados v. 23
nas diferentes exposições foi calculada a CL 50
da através de análises de probit utilizando
um software adequado.
Segundo a OECD (2013), o teste de
embriotoxicidade em peixe-zebra fazendo
uso da concentração limite de 100 mg/L da
substância teste deve ser utilizado quando
se tem indícios de que a amostra em estudo
possivelmente é inócua ou apresenta baixa
toxicidade contra vertebrados. No que diz
respeito a Mo-CBP 3 , dois fatos nos davam
indícios de que possivelmente Mo-CBP 3 não
causaria efeitos deletérios em embriões de