No obstante, su actividad profesional no se vio mermada del todo.
El 8 de noviembre de 1895, cuando se encontraba experimentando el poder de penetración de los rayos catódicos, observó que una placa de cartón cubierta de cristales de platino-cianuro de bario, emitía una fluorescencia. Ésta desaparecía cuando desconectaba la corriente. Siguió repitiendo el experimento porque era más partidario de investigar que de pensar ("Yo no pienso, investigo"). Pronto descubrió que esos rayos (que él llamó "X") (también se conocen con el nombre de rayos Röntgen) atravesaban distintos tipos de materiales como papel, madera, una delgada lámina de alumnio, etc., pero el plomo no. También se dio cuenta de que al sostener un aro de plomo con sus dedos, no sólo veía el aro sino también los huesos de su mano. Se le ocurrió que podía "imprimir" la imagen en una placa fotográfica. Fue así como hizo la primera radiografía. El 28 de diciembre de 1895 entregó el trabajo "Sobre una nueva clase de rayosComunicación preliminar", (Vorläufigen Mitteilung über Eine neue Art von Strahlen, Verlag und Druck der Stahel'schen K. Hof- und Kunsthandlung Würzburg, 1895)
al secretario de la Sociedad Física y Médica de Würzwurg. Se publicó en pocos días y envió separatas a todos sus amigos. Prácticamente en un reducido espacio de tiempo la noticia apareció en todos los periódicos y diarios de gran difusión, produciendo un gran impacto entre el público general.
En febrero de 1896 Röntgen tomó una radiografía de un brazo fracturado y la mandó al British Medical Journal para probar el extraordinario poder diagnóstico de su hallazgo. El trabajo apareció publicado el mismo mes. Sin embargo, no se ocupó más de su descubrimiento en lo que se refiere a su utilidad médica, sino que sus intereses siguieron en el campo de la física. Este hallazgo le reportó premios, condecoraciones y diversos nombramientos honoríficos en todo el mundo, que se alargaron hasta su muerte. En 1901 recibió el primer premio nobel de física, cuya cuantía donó a la Universidad en apoyo de la investigación.
Tras el importante hallazgo otros pretendieron atribuirse el descubrimiento. Röntgen nunca ocultó que se basó en trabajos de otros (J. Plucker (1801-1868), J. W. Hittorf (1824-1914), C. F. Varley (1828-1883), E. Goldstein (1850-1931), Sir William Crookes (1832-1919), H. Hertz (1857-1894) and Ph. von Lenard (1862-1947).
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