2
BÖLÜM 1
ŞEKİL 1–1
■
Histoloji ve Çalışma Yöntemleri
Tespit edilmiş ve bloklanmış dokudan kesit alma.
Dokuların çoğunda histolojik olarak çalışma yapılabilmesi için belli
basamaklara göre sırayla belli işlemler uygulanır (a):
■ Tespit: Küçük doku parçaları prtoteinleri çapraz bağlayan ve
parçalayıcı enzimlerin aktivitesini durduran kimyasal çözeltiler içine alınır.
■ Dehidratasyon: Doku derişimi artarak %100'de sona eren alkol serilerinden geçirilir. Bu şekilde doku içindeki su tamamen
uzaklaştırılır.
■ Şeffaflaştırma: Alkolü ve parafini çözebilen toluen ya da başka ajanlarla doku içinde suyun yerini almış olan alkol uzaklaştırılır.
■ Parafinle doyurma: Doku, boşlukları tamamen parafinle doluncaya dek eritilmiş parafin içinde bekletilir.
■ Gömme: Parafinle doyurulmuş olan doku eritilmiş parafinle doldurulmuş küçük kalıplara konur ve oda sıcaklığında sertleşmeye bırakılır.
■ Kesite hazırlama: Elde edilen parafin bloktaki dokunun kesit
yüzeyi açılarak mikrotomla kesit alınmaya hazır hale getirilir.
aynı olacak biçimde korunmuştur. Ancak uygulamada bu durum ender olarak gerçekleştirilebilmekte ve preparatın hazırlanış yönteminden ötürü hemen her zaman doku hazırlama kusurları (artefakt), bozulmalar oluşmakta ve doku bileşenleri
kaybolmaktadır. Işık mikroskobu incelemesi için doku hazırlama işleminin temel adımları Şekil 1.1’de gösterilmektedir.
Tespit
Kesitin kalıcı olması için dokuların tespit edilmesi gerekir. Dokuların bakteriler ya da hücre içi enzimlerce parçalanmasını (otoliz) önlemek, hücre ve doku yapısını korumak için, or-
Geçirimli elektron mikroskobu için gerçekleştirilen hazırlıklarda
doku örneğinin çok daha küçük olması, tespit ve dehidratasyon
sıvılarının farklı olması ve çok ince kesit alabilmeyi sağlamak için
gömme ortamı olarak parafinden daha sert olan epoksi kullanılması dışında benzerdir.
(b) Işık mikroskobu ile incelenecek olan parafine gömülmüş
dokulardan kesit alabilmek için mikrotom kullanılır. Kesite hazırlanan doku, parafin blok tutucusuna yerleştirilir ve çarkın her dönüşü sırasında kesit yüzeyi genellikle 1-10 mikrometre arasında
bir mesafe ile bıçağa doğru kontrollü bir biçimde ilerletilir. İleriye
doğru gelen bloğun kesit yüzeyi çelik bıçak üzerinden geçerken
kesilir ve bir sonraki kesite dek aynı işlemler yinelenir. Parafin kesitler lam üzerine alınarak parafinden arındırılır ve ışık mikroskobu
incelemesi için boyanır. TEM için alınan kesitlerin kalınlığı 1 mikrometreden daha incedir. Bu dokular rezin içine gömülmüştür ve kesit almak için cam ya da elmas bıçaklar kullanılır.
gan parçalarının vücuttan alındıktan sonra mümkün olduğunca çabuk işlenmesi gerekir. Bu ilk işlem –tespit- genellikle tespit maddesi olarak adlandırılan tespit edici ya da çapraz bağlı
bileşikler oluşturucu çözeltilerin içerisinde bekletmeyi gerektirir. Çünkü tespit maddesi, tüm hücreleri korumak için dokuların içerisine tam olarak dağılabilmelidir. Tespitten önce dokular genellikle tespit maddesinin doku içine girişini kolaylaştırmak ve dokunun daha iyi korunmasını sağlamak amacıyla küçük parçalara bölünür. Bazı organlar ve laboratuvar hayvanlarında tespit sıvılarının damar yoluyla perfüzyonu gerçekleştirilebilir. Bu işlemde tespit sıvısı, kan damarları aracılığıyla hızlı bir biçimde dokulara ulaşır, tespit işlemi daha iyi gerçekleşir.