El bacteri conté DNA-T (transformant) que forma part del plasmidi TI (inductor de tumors) d'unes 200 Kb. El DNA-T conté gens de fitohormones i una opina (intermediari d'aminoàcids). El DNA-T està limitat per unes repeticions directes.
En la resta del plasmidi hi trobem: ori C, catabolisme d'opines i la regió vir (són els gens necessaris per transferir el DNA-T).Les opines són font de carboni i nitrogen per Agrobacterium.Agrobacterium obliga als vegetals a fabricar les opines que ell necessita.
El bacteri entra quan hi ha una ferida i mitjançant una conjugació la cèl·lula expressa fitohormones i les opines necessàries.
Per fer plantes trangèniques només cal eliminar el gen de la fitohormona i el gen de síntesi i en el seu lloc col·loquem els gens que volem transferir i els marcadors per fer la selecció.(cal tenir en compte que el tamany dels gens i marcadors no sigui gaire més gran que el tamany que tenien els gens anteriors).
Quan ja tenim el vector preparat infectem una ferida i esperem que es dongui conjugació que el palmidi que conté Agrobacterium passi a les cèl·lules vegetals(usem protoplastes)i tingui lloc la recombinació per zones d'homologia i el gen quedi integrat al genoma de la cèl·lula. Posteriorment seleccionem les cèl·lules que han incorporat el DNA-T a través de la neomicina fosforil transferasa II, les cè·lules resistents a l'antibiòtic són les que han incorporat el transgen per tant les que ens interessen. A partir d'aquestes cèl·lules podem obtenir plantes transgèniques.Haurem de revisar que el transgen s'expressi.
Sistema binari
El plasmidi Ti és un vector helper, té els gens necessaris per la transferència (gens vir) i DNA-T.
A demés tenim un plasmidi pBR322 que conté ori C, gen de resistència a Amp, dos seqüències repetides directes de DNA-T i comprès entre aquestes dues seqüències hi ha els gens d'interès, que són:
-el promotor de dicotiledònies
-elements de regulació com el S35
-npt II
-gen a insertar
El pBR322 el transferim a soques d'Agrobacterium que tinguin el plasmidi Ti. Els factors vir actuen en trans sobre el DNA-T del plasmidi pBR322 i permet la transferència a les cèl·lules vegetals (no cal que hi hagi integració).
Biolística i fibres de carbur de silicona
Tenim unes biobales de tungstè o or que recobrim amb el nostre vector (obtenint així les bales recobertes de DNA), les col·loquem en una boca de canó i fem que les microbales es dirigeixin cap als nostres protoplasmes. Els canons que s'usen són d'heli que permeten una elevada acceleració de les biobales que ens donarà una gran penetrància. Aquestes bales entraran a la cèl·lula introduint així el transgen.
Finalment hauríem de fer una selecció amb l'antibiòtic.
Aquest mètode té molts avantatges:
-és fàcil d'utilitzar
-un dispar pot produir múltiples integracions
-les cèl·lules poden sobreviure a varis dispars
-els gens que recobreixen la partícula recuperen la seva activitat biològica
-les cèl·lules diana poden ser de diferents tipus
-les partícules arriben a les capes cel·lulars més profundes
Aquesta tècnica no requereix de vectors és una tècnica molt més simple però d'altra banda la seva eficàcia és relativament baixa i calen moltes biobales per a obtenir resultats satisfactoris.
La biolística ha estat el mètode més utilitzat per a la obtenció de monodicotoledònies transgènques com ara arròs, blat de moro, soja, blat... i algunes dicotiledònies.
Fibres de carbur de silicona
S'intenta simular la biolística. Recobrim les fibres amb el DNA i ho posem en un eppendorf on hi tenim les cèl·lules vegetals. Vortegem de manera que les fibres surten disparades com a fletxes clavant-se així en les cèl·lules.
Transferència electroforètica
Agafem una llavor amb dues pipetes, una conté solució tampó amb el DNA i l'altra agafa la llavor. Una té un electròde positiu i l'altra un de negatiu, fem passar una corrent i el DNA es transfereix de la pipeta a la llavor.
Cointegració
Introduïm dins el DNA-T un plasmidi d'E. coli que tots els elements necessaris de control:
-gen npt II (resistència a kanamicina)
-ori C
-lloc de clonació
-DNA-T
-resistència a ampicilina
En el punt de clonació hi inserim els gens que volem que expressi la planta. Seleccionem les cèl·lules resistents a ampicilina que són les que hauran incorporat el plasmidi i les conjuguem amb l'Agrobacterium.
El plasmidi d'Agrobacterium i E. coli tenen zones d'homologia que és el DNA-T de manera que es podrà donar recombinació. Fem un cultiu i seleccionem les cèl·lules resistents a kanamicina que donaran les plantes modificades genèticament.