Extracción de DNA
Para la obtención de DNA se modificó un protocolo de extracción fenólica optimizado para la recuperación de ácidos nucleicos desde microorganismos ( Bowman et al ., 2016 ). Las muestras de pelo o cultivo , fueron resuspendidas en 400 µ L de buffer STE ( NaCl 200mM - Tris 200 mM & EDTA 20 mM ), y se agregaron 2 µ L de Zimoliasa desde una concentración inicial de 20 ng /µ L ( Zymo Research , USA ) más 2 µ L de β-mercaptoetanol y 20 µ L de SDS al 20 %. La suspensión fue incubada por 1 h a 37 ° C y luego fue traspasada a tubos con 200 µ L de perlas de vidrio de 425-600 µ m ( Sigma , USA ) y 400 µ L de una solución de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico en una proporción 25:24:1 pH 8 . La suspensión fue sometida a ruptura celular por 5 minutos utilizando un equipo Analog Disruptor Genie ( Scientific Industries , USA ). Las fases fueron separadas por centrifugación , recuperando la fase acuosa sobrenadante , a la cual se le agregó una solución de cloroformo : alcohol isoamílico 24:1 para eliminar trazas de fenol . Luego , el DNA fue precipitado utilizando 1 volumen de isopropanol frío y 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M pH 5.5 , incubándolo por 1 hora a -20 ° C . Posteriormente , las muestras fueron centrifugadas y el DNA precipitado fue lavado con etanol frío al 70 %. El etanol fue removido desde las muestras mediante aspiración , y el DNA fue secado durante 30 min a 37 ° C para finalmente disolverlo en 50 µ L de agua libre de DNAsas ( IDT , USA ).
Diseño de partidores para amplificar el gen MEP3
Para detectar la presencia de M . canis , se amplificó mediante PCR y / o qPCR parte de la secuencia del gen MEP3 , el cual codifica para una metaloproteasa involucrada en la patogenicidad de M . canis ( Brouta et al ., 2002 ). La secuencia nucleotídica del gen MEP3 se obtuvo desde la base de datos GeneBank ( clave de acceso AJ490183 ) y se utilizó para el diseño de partidores especie-específicos utilizando la herramienta web PrimerBlast ( Jian et al ., 2012 ). Se diseñaron 2 conjuntos de partidores con un largo de 20 nucleótidos cada uno y con una temperatura de fusión de 57 ° C ( Tabla 1 ). El primer conjunto de partidores se diseñó para PCR convencional , los cuales
9 amplifican una región de 488 pares de bases ( pb ), mientras que el segundo conjunto se diseñó para qPCR , resultando en un amplificado de 149 pb .
PCR convencional
Para la amplificación convencional de DNA se utilizó un equipo Veriti 96 well thermal cycler ( Applied Biosystems , USA ), empleando por cada muestra una mezcla de 4,8 µ L de MgCl2 ( 25 mM ), 1,5 µ L de dNTP ’ s ( 100 mM ), 1 unidad de GoTAQ DNA polimerasa ( Promega , USA ), 6 µ l de tampón de reacción GoTAQ , 1,5 µ L de cada partidor ( 10 µ M de cada uno ) y 2 µ L de DNA previamente diluido a una concentración de 10 ng /µ L , completando con agua libre de nucleasas para un volumen final de 30 µ L por reacción . Las muestras de DNA fueron amplificadas utilizando un ciclo inicial de denaturación a 94 ° C por 2 min , seguido por 40 ciclos compuestos por una denaturación a 94 ° C por 30 seg , 30 seg de apareamiento de partidores según la temperatura de fusión de cada uno ( Tabla 1 ) y 30 seg de elongación a 72 ° C , finalizando con 1 ciclo de elongación final por 5 minutos a 72 ° C . La amplificación de DNA del PCR convencional se observó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %, utilizando TAE como tampón .
PCR cuantitativo
Para realizar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa ( qPCR ) se utilizó un equipo AriaMx Realtime PCR System ( Agilent , USA ), empleando por reacción de amplificación 1 µ L de DNA previamente diluido a una concentración de 10 ng /µ L , 0,4 µ L de cada partidor ( 10 µ M de cada uno ), 3,6 µ L de H2O libre de DNAsas y 5 µ L de Master Mix SensiFAST SYBR No-ROX kit ( Bioline , UK ), para un volumen final de 10 µ L . Las muestras fueron amplificadas utilizando un ciclo inicial de denaturación a 50 ° C por 2 min y 95 ° C por 2 min , seguidos de 40 ciclos compuestos por una denaturación a 95 ° C por 3 seg , 10 seg de apareamiento de partidores a 62 ° C y 20 seg de elongación a 72 ° C , finalizando con 1 ciclo de Melting con rampas de temperatura de 30 seg a 95 ° C , 30 seg a 62 ° C y 30 seg a 95 ° C . Los datos de amplificación fueron observados utilizando el programa