computacional Agilent Aria Software v1.3 y graficados utilizando Excel 2016 ( Microsoft , USA ).
Secuenciación de DNA y alineamiento de las secuencias
El DNA amplificado resultante desde el qPCR fue enviado a secuenciar al servicio Macrogen ( Corea ), siguiendo las instrucciones entregadas por el proveedor . En breve , 10 µ L de la reacción resultante luego de la amplificación por qPCR fueron almacenados en tubos Eppendorf de 1,5 mL , sellados con parafilm M ( Merck , Alemania ) y enviados a través de correo prioritario al servicio de secuenciación , junto a 10 µ L del partidor forward de Mep3 _ 149 . Para identificar a qué microorganismo pertenecen las secuencias obtenidas se utilizó la herramienta bioinformática en línea BLAST ( Altschul et al ., 1990 ). Para realizar el alineamiento y cálculo de distancias filogenéticas de las secuencias obtenidas , se utilizó el lenguaje estadístico R junto al paquete de alineamiento DECIPHER ( Wright , 2015 ).
Resultados PCR convencional
La amplificación del DNA fue realizada mediante PCR convencional según como se indica en la sección de materiales y métodos , utilizando los partidores diseñados en este estudio y partidores diseñados por otros trabajos que identifican la presencia del gen de la quitina sintasa ( Dabrowska et al ., 2014 ) y de la región ITS1 de DNA ribosomal ( Brillowska-Dabrowska et al ., 2013 ) ( Tabla 1 ). En una primera etapa , utilizamos DNA obtenido desde una muestra de pelo positiva a M . canis y desde placas de cultivo puras de M . canis , con el objetivo de comprobar que la reacción en cadena amplifica el DNA con el tamaño para el cual se diseñaron los partidores . La amplificación se realizó junto a un control negativo para cada partidor . En general , observamos que tanto el DNA obtenido desde pelo , así como el DNA obtenido desde el cultivo puro de M . canis amplificó según los tamaños esperados ( Figura 1 ), además , los controles negativos no generaron amplificados , solo observándose la presencia de dímeros de partidores por bajo los 100
10 nucleótidos . Esto indica que los amplificados obtenidos en las reacciones que poseen DNA proveniente desde pelo y de cultivo microbiológico fueron el resultado de la presencia del DNA de M . canis y no por auto-apareamiento de partidores . Interesantemente , el conjunto de partidores Mcfor & Mcrev mostró un patrón de amplificación inespecífico para las muestras de DNA obtenidas desde pelo , corroborando la inespecificidad de los métodos descritos en literatura que detectan la presencia de genes que no son exclusivos de M . canis .
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y secuenciación de DNA amplificado
Debido a que el PCR convencional necesita de un paso adicional de electroforesis en gel de agarosa para la observación de los resultados obtenidos , este tarda algo más que el PCR cuantitativo , el cual muestra los resultados de amplificación a medida que la reacción avanza . Por tal motivo , diseñamos un partidor para amplificar el gen MEP3 mediante qPCR , el cual produce un fragmento de DNA de 149 nucleótidos . Para probar la detección , utilizamos las muestras de DNA obtenidas desde pelo de perros , gatos y del cultivo de M . canis . Los resultados mostraron la amplificación de las muestras positivas a M . canis en ciclos tempranos de la reacción ( alrededor del ciclo 15 ), mientras que las muestras de DNA obtenida de pelo amplificaron entre los ciclos 20 al 27 . Por su parte , el control negativo no amplificó , indicando que los valores de fluorescencia obtenidos en las muestras problemas provienen de la amplificación de la presencia del DNA del gen MEP3 ( Figura 2 ).
Algunos de los productos resultantes de la reacción de qPCR fueron enviados a secuenciar para determinar si los amplificados obtenidos corresponden a la secuencia del gen MEP3 . Mediante BLAST determinamos que la identidad de las 7 muestras secuenciadas ( Canino = 3 , Felino = 2 y DNA desde cultivo puros positivos a M . canis = 2 ) corresponden a la región que se esperaba amplificar para el gen MEP3 de M . canis ( Tabla 2 ). El alineamiento de las secuencias nucleotídicas mostró que las 7 secuencias obtenidas tienen una relación filogenética cercana con las secuencias del gen MEP3 de M . canis y su