MEMORIAS DE SEMINARIOS POSGRADO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS ITTEPIC MEMORIAS DE SEMINARIOS AGOSTO DICIEMBRE 2018 | Page 25

EFECTO DE LA SOBREEXPRESIÓN EN Arabidopsis thaliana DE LOS GENES
HOMÓLOGOS A LOS INVOLUCRADOS EN LA BIOSÍNTESIS DEL COMPUESTO
ANTIFÚNGICO PERSINA EN AGUACATE HASS (Persea americana)
Presenta: IBQ Gloria Arlette Rodríguez Aguirre
Director: Dra. Alejandra Chacón López
Co-Director: Dra. Selene Aguilera Aguirre
Fecha: 12 de Diciembre del 2018
Maestría en Ciencias en Alimentos Seminario de Culminación
El aguacate (Persea americana) es uno de los cultivos más importantes en México, sin embargo, la
comercialización de este fruto es reducida debido a pérdidas generadas por el desarrollo de
enfermedades causadas por fitopatógenos como Colletotrichum gloeosporioides agente causal de la
antracnosis. Se ha reportado que el fruto de aguacate en madurez fisiológica, contiene compuestos con
actividad antifúngica, entre los cuales se encuentra (12z, 5z)-1-acetoxy-2-hydroxy-4-oxo-heneicosa-
1
12,15-diene (persina) que inhibe el desarrollo de este fitopatógeno . Los genes Avfad 1, y Avfae 12-3,
están involucrados en la biosíntesis de persina y se inducen al estimular el sistema de defensa del fruto
por algún elicitor, por lo que el fruto presenta resistencia al ataque del hongo aún cuando éste ha
2
alcanzado su madurez de consumo .
El objetivo de este trabajo es evaluar el efecto de la sobreexpresión en Arabidopsis thaliana de los genes
homólogos a los involucrados en la biosíntesis del compuesto antifúngico persina de aguacate Hass
(Persea americana) y evaluar la actividad antifúngica in vitro de extractos obtenidos de las
sobreexpresantes.
La metodología se llevó a cabo de la siguiente manera: inicialmente se realizó un análisis bioinformático
para determinar los genes de A.thaliana homólogos a Avfad 1 y Avfae 12-3. Se seleccionaron los genes
que presentaron mayor porcentaje de homología. A partir de estas secuencias se diseñaron
oligonucleótidos específicos para la amplificación de los genes de interés. Por otro lado se llevó a cabo la
extracción de RNA total de plantas de A.thaliana ecotipo (col-0), para obtener cDNA mediante la enzima
transcriptasa reversa. El cDNA se empleó como molde para amplificar por PCR las secuencias
específicas de los genes homólogos entre aguacate y A .thaliana. El tamaño del producto de PCR se
comprobó por electroforesis. Estos fragmentos (correspondientes a cada uno de los genes) fueron
clonados en vectores para establecer su expresión constitutiva utilizando el sistema Gateway, el cual
consiste en el empleo de dos vectores de clonación, el pDONR 2.21 como vector de entrada y el
pB7WG2 como vector de expresión. Las construcciones obtenidas fueron introducidas en Agrobacterium
tumefaciens para transformar A. thaliana, ya que esta bacteria es el vehículo natural de transmisión de
los genes en la planta. Las plantas sobreexpresantes fueron seleccionadas con el herbicida
fosfinotricina. Los fenotipos de las plantas sobreexpresantes fueron comparados con un control.
Finalmente se evaluó la actividad antifúngica de extractos vegetales provenientes de plantas
sobreexpresantes para cada uno de los genes bajo estudio.
Como resultados se presentan a partir del análisis bioinformático las secuencias homólogas en A.
thaliana; para Avfad 1 el gen con mayor homología fue At5g43760 el cual tiene función de respuesta a
frío y estímulo de luz, mientras que para el gen Avfae 12-3, el homólogo fue At3g12120, el cual codifica
para una enzima involucrada en la síntesis de ácidos grasos. Se obtuvo el RNA total de A. thaliana con
una concentración de 325 ng/µL, el cual se empleó para obtener el cDNA. Con el cDNA se logró obtener
los amplicones At3g12120 (1212pb) y At5g43760 (1650pb). Se logró la clonación de cada gen mediante
recombinación de sitio específico en los vectores Gateway. Se obtuvieron las líneas sobreexpresantes
3
de A. thaliana por la técnica de floral-dip (Clough et al., 1998) al introducir las construcciones realizadas.
Las líneas transformadas, mostraron algunas diferencias en su fenotipo con respecto a las plantas
control, como color de las hojas más intenso, cambio en la estructura de la raíz y las inflorescencias se
presentaron en etapa más temprana del desarrollo de la planta. Finalmente, con respecto a la evaluación
de la actividad antifúngica de los extractos obtenidos a partir de las líneas sobreexpresantes se observó
un porcentaje de inhibición del 45% sobre el hongo C.gloeosporioides.
De acuerdo a los resultados se puede concluir que las plantas sobreexpresantes tiene un efecto
inhibitorio frente al desarrollo del hongo C.gloeosporioides, lo cual podría representar una estrategía para
su control, sin embargo son necesarios más estudios para asegurar su inocuidad en alimentos.
1. Djami-Tchatchou, A. T., Allie, F., & Straker, C. J. (2013). Expression of defence-related genes in avocado fruit (cv. Fuerte) infected with
Colletotrichum gloeosporioides. South African Journal of Botany, 86, 92–100.
2. Xoca, L., Cuellar, E., González, S., Gutiérrez, P., López, U., Herrera, E., Vega, J.,Chacón, A. (2017). Transcriptomic Analysis of
Avocado Hass (Persea americana Mill) in the Interaction System Fruit-Chitosan-Colletotrichum. Frontiers in Plant Science, 8(June), 95.
3. Clough, S. J., Bent, A. F. (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant
J. 16, (6), 735-743.