MEMORIAS DE SEMINARIOS POSGRADO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS ITTEPIC MEMORIAS DE SEMINARIOS AGOSTO DICIEMBRE 2018 | Page 18

ESTUDIO DE GENES QUE CODIFICAN PARA UNA SINTETASA DE PÉPTIDOS NO
RIBOSÓMICA INVOLUCRADOS EN LA PRODUCCIÓN DE FASEOLOTOXINA EN
P. syringae pv. phaseolicola, AGENTE CAUSAL DEL TIZÓN DE HALO DEL FRIJOL
Presenta: I.T.B. Edwin Eduardo López García
Director: Dra. Selene Aguilera Aguirre
Co-Director: Dra. Susana De la Torre Zavala
Fecha: 11 de Diciembre del 2018 Maestría en Ciencias en Alimentos
Seminario de Culminación
El frijol es un cultivo afectado por diversas enfermedades como el tizón de halo, el cual es causado por la
bacteria Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, que produce una toxina denominada faseolotoxina,
responsable de la producción de los halos cloróticos. La faseolotoxina está constituida por un tripéptido
(Ornitina-Alanina-Homoarginina) unido a un residuo inorgánico 1 . Se ha reportado que la región
cromosómica que se denomina Pht, participa en la síntesis y regulación de la faseolotoxina 2 . Por otra parte,
también se reportó la participación del gen PSPPH_4550, el cual se encuentra codificado fuera de la Región
Pht. Se ha propuesto que este gen codifica para una enzima involucrada en el proceso de síntesis de
péptidos no ribosómica y que podría participar en la síntesis del tripéptido de la faseolotoxina. Este gen
forma parte de una región cromosómica que estaría compuesta de varios operones (región PSPPH), donde
todos ellos participarían de manera conjunta en este proceso 3 . La producción de distintas toxinas de
P. syringae se ven asociadas por estas rutas biosintética. En este sentido, se ha propuesto que a través
de estos sistemas multienzimáticos se podría estar llevando a cabo la síntesis de faseolotoxina en P.
syringae pv. phaseolicola.
El objetivo del presente estudio fue caracterizar genes involucrados en la síntesis no ribosómica de péptidos
en P. syringae pv. phaseolicola NPS3121.
Para llevar a cabo este análisis, se realizó la búsqueda de las secuencias de los genes de la región PSPPH,
incluyendo el PSPPH_4550. Para amplificar los genes mediante PCR, se diseñaron oligonucleótidos
utilizando el software Vector NTI ® . Por otra parte, se realizó un análisis in silico de los genes comprendidos
en región PSPPH para determinar su probable organización de los operones. Se determinó la homología
de las proteínas codificadas por estos genes y las reportadas en las bases de datos, para lo cual se empleó
el software Phyre 2 . Para caracterizar el patrón de expresión de los genes PSPPH, se purificó el RNA total
de P. syringae pv. phaseolicola NPS3121 utilizando el reactivo Trizol y a partir de cultivos bacterianos
incubados bajo condiciones de síntesis de faseolotoxina. Para evaluar el patrón transcripcional de los
genes, se llevaron a cabo análisis de Transcripción reversa acoplada a PCR (RT-PCR). Se establecieron
las condiciones de amplificación para cada gen y los productos amplificados fueron sometidos a
electroforesis para su análisis.
Resultados obtenidos durante los análisis in silico, sugieren que la región PSPPH, estaría comprendida por
18 genes, del PSPPH_4541 al PSPPH_4558. De manera similar a los genes de la Región Pht, que se
encuentran organizados en operones 2 , los genes PSPPH podrían estar organizados en 8 unidades
transcripcionales. Por otra parte, el análisis a nivel de las secuencias de las proteínas, reveló que algunos
de los genes PSPPH codifican para enzimas que podrían estar involucradas en el mecanismo de síntesis
de péptidos no ribosómicas, de manera similar a lo propuesto para el gen PSPPH_4550. Este análisis de
homología permitió determinar los bordes del fragmento cromosómico PSPPH ya que se identificaron
genes que codifican para transposasas, las cuales no están asociadas a la síntesis de péptidos no
ribosómicas, sino que se relacionan con los mecanismos de transferencia horizontal 2 . Por otra parte, los
análisis de la expresión de los genes mediante RT-PCR, revelaron que los genes PSPPH se transcriben
de manera diferencial con respecto a la temperatura de incubación. Este patrón de transcripción se ha visto
en otros genes involucrados en la síntesis de faseolotoxina 3 .
Se concluye que los genes aledaños a PSPPH_4550, conforman un fragmento cromosómico. Este
fragmento contiene 8 operones que de manera coordinada, participarían en la síntesis de faseolotoxina,
particularmente sintetizando la porción orgánica del tripéptido. Adicionalmente, estos genes podrían
constituir una isla genómica adquirida por eventos de transferencia horizontal.
1. Mitchell, R., Bieleski, R. (1977). Involvement of phaseolotoxin in halo blight of beans. Transport and conversion to functional toxin. Plant
physiol. 60, 723-729.
2. Aguilera, S., López, K., Nieto, Y., Garcidueñas, R., Hernández, G., Hernández, J., Murillo, J., Álvarez, A. (2007). Functional characterization
of the gene cluster from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola NPS3121 involved in synthesis of phaseolotoxin. Journal of Bacteriology,
189(7), 2834-2843.
3. De la Torre, S., Aguilera, S., Ibarra, E., Hernández, J., Hernández, A., Murillo, J., Álvarez, A. (2011). Gene expression of Pht cluster genes
and a putative non-ribosomal peptide synthetase required for phaseolotoxin production is regulated by GacS/GacA in Pseudomonas syringae
pv .phaseolicola. Research in Microbiology, 162, 488-498.