6
BÖLÜM 1
■
Histoloji ve Çalışma Yöntemleri
lanırken, yüksek büyütme sağlayan objektiflerin daha yüksek
çözme gücüne sahip olduğu da dikkate alınmalıdır.
Sayısal kameralar, aydınlık-alan ve diğer ışık mikroskoplarında ışık gücünün arttırılabilmesine ve görüntünün fotoğraflanarak sayısal analizler için uygun hale getirilmesine ve
dijital kameralar ve görüntü-iyileştirme programlarının (ör:
kontrastın artırılması) kullanılmaya başlanmasıyla ışık mikroskobunun sınırları yeniden çizilmiş, okülerden bakıldığında
görülemeyen nesneler video ekranında analiz edilebilir hale
gelmiştir. Bu tür sistemler ayrıca, canlı hücrelerle yapılan uzun
süreli çalışmalarda çok kullanışlıdır; düşük şiddette ışık kullanıldığından, hücreleri yoğun aydınlatmadan kaynaklanan ısı
hasarının önüne geçilmiş olur. Görüntü analizleri için geliştirilen yazılım programları, mikroskobik yapılar üzerinde hızlı
ölçümlerin ve sayısal çalışmaların yapılmasına olanak tanır.
ŞEKİL 1–4
Floresan Mikroskobu
Belli hücresel yapılar uygun dalga boyundaki bir ışığa tabii tutulduklarında, daha uzun dalga boyunda bir ışık yayarlar bu
olağanüstü olaya floresan denir. Floresan mikroskobunda, doku kesitleri genellikle ultraviole (UV) ışık ile uyarılır
ve spektrumun görünür bir kısmında ışıma yapar. Floresan
maddeler siyah bir zemin üzerinde parlak olarak görülürler.
Bu yöntem için, mikroskop kuvvetli bir ultraviole (UV) ışık
kaynağı ve maddeler tarafından yayılan değişik dalga boylarındaki ışığı seçilen yollara aktaran özel filtrelere sahiptir.
Floresan boyamalarda özgül hücre makromoleküllerine
afinite gösteren floresan bileşikler kullanılabilir. Örneğin akridin oranj, DNA ve RNA’nın her ikisine birden bağlanabilir. Floresan mikroskop ile incelendiğinde, bu nükleik asitler,
hücre içerisinde ayrı ayrı görülmelerine olanak veren, hafif,
farklı floresans yayar (Şekil 1-4a). DAPI ve Hoechst gibi diğer
bileşikler, özgül olarak DNA’ya bağlanarak genellikle hücre
Floresan mikroskop ile hücrelerin görünümü
Hücre bileşenleri sık olarak floresan mikroskobu ile görünebilir
bileşiklerle boyanır.
(a) Akridin oranj nükleik asitlere bağlanır ve bu resimde görülen
böbrek tübül hücrelerinin çekirdeklerindeki (N) DNA’nın sarı ışık
yaymasına ve RNA’dan zengin hücre sitoplazmalarının (R) da
turuncu renkte görünmesine neden olur.
(b) Kültürde çoğaltılan hücreler DNA’ya bağlanan DAPI (4’,
6-diamino-2-phenylindole) ve aktin filamanlarına bağlanan
flourescein-phalloidin ile boyandıklarında, çekirdekler mavi floresan gösterirken aktin filamanları yeşile boyanır. Mikrofilamanların
hücre çeperine yakın bölümde daha yoğun olması gibi önemli
bilgiler bu şekilde somut hale getirilmiş olur. Her iki fotğraf için de
büyütme X500.
(Şekil 1-4b, Indiana University School of Medicine,
Bloomington’dan Drs Claire E. Walczak ve Rania Risk’in izniyle)