ПОВОЛЖСКИЙ
ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ
ВЕСТНИК
3(25)’2016
ткани из первичной опухоли и/или отдаленных метастазов, залитые в парафиновые блоки. Выделение
опухолевых клеток производили методом стереотактической диссекции под контролем световой микроскопии со срезов, содержавших более 40% опухолевых клеток. После проведения ПЦР для достижения
необходимого числа копий ДНК осуществляли определение мутаций по отклонению кривых плавления.
Выделение ДНК из опухолевого материала проводили с помощью наборов «ДНК-ткань-Ф» (ТестГен, Димитровград) согласно инструкции компании-производителя (для парафиновых блоков использовались
4 среза толщиной 10 мкм).
Стандартные плазмидные образцы, содержащие
мутации, использовали в качестве положительного
контроля. Искусственно синтезированные фрагменты
ДНК размером 300 п.н., содержащие мутацию, вставляли в вектор pAL-TA. Плазмиды со вставкой были
произведены ЗАО «Евроген» (г. Москва). Концентрацию определяли с помощью метода стандартных разведений, используя в качестве референса геномную
ДНК Jurkat Genomic DNA (Thermo Fisher, США). Содержание мутантной ДНК варьировалось от 0 до 10%.
Для детекции мутаций в гене K-ras, использовали
смеси праймеров и зондов в конечных концентрациях 900 и 600 нМ соответственно. Для ПЦР «в реальном времени» использовали термоциклер «RotorGene 6000» (Qiagen, Германия), ПЦР-смесь готовили в
20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ
Трис-HCl, pH 8.8, 16.6 мМ сульфат аммония, 0.01%-ный
Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP,
500 нМ праймеров, 250 нМ флуоресцентных зондов,
1.5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Условия амплификации
фрагментов ДНК: 95C/2 мин – 1-й цикл; 94C/10 сек,
62C/60 – 60 циклов.
Комплекты олигонуклеотидов были разработаны
и произведены ООО «Тестген» (г. Димитровград).
Список определяемых мутаций в генах KRAS, представлен в таблице.
Таблица. Мутации, определяемые в гене K-ras
В кодоне 12
В кодоне 13
Gly12Ser (GGT>AGT)
Gly13Asp (GGC>GAC)
Gly12Arg (GGT>CGT)
Gly12Cys (GGT>TGT)
Gly12Asp (GGT>GAT)
Gly12Ala (GGT>GCT)
Gly12Val (GGT>GTT)
Статистическую обработку данных проводили с
использованием пакета статистических программ
на IBM-совместимом персональном компьютере с
использованием приложений Microsoft Excel пакета
Office XP Service Pack 2 и Statistica (StatSoft) версии 6.0.
Для проведения сравнительного анализа полученных
данных был применен критерий Стьюдента. Исследование показателей выживаемости проводили методом Каплана – Майера.
Результаты собственных исследований
Из 120 пациентов у 35 выявлена мутация в гене
K-ras, у 85 пациентов имелся «дикий» тип гена (частота
мутаций составила 26,7%). Это несколько меньше, чем
в целом по России, что, вероятно, связано с выраженной этнической гетерогенностью населения в данном
регионе. Все мутации были обнаружены в первичной
опухоли. Мутации гена K-ras в 12 кодоне наблюдали
в 68% случаев, в 13 кодоне – в 32% соответственно.
Преимущественно в g12v(20%), g13d(33%), g12d(20%),
g12s(7%), g12c(20%) кодонах.
У женщин частота мутаций в гене K-ras встречалась
чаще – в 37,7%, чем у мужчин – 20,3%. Данные зависимости значимы (р=0,045).
В отличие от других исследований, мы отметили
снижение частоты мутации в гене K-ras в более старших возрастных группах – менее 10% в возрасте старше 60 лет и 56,3% в возрасте до 50 лет. Данная зависимость статистически значима (р=0,001).
Республика Татарстан имеет свои популяционные особенности. На ее территории проживают 2
титульные нации примерно в равной численности.
На протяжении многих столетий совершались межнациональные браки. Тем не менее, результаты наших исследований показали, что у пациентов русской
национальности мутации гена K-ras встречались не сколько чаще – в 39%,чем у татар – 21% (р=0,045). У пациентов, имеющих регионарные метастазы, мутации
гена K-ras встречались значительно чаще, – 45,8%,
чем при их отсутствии – 4,9%. Данная зависимость является статистически значимой (р=0,001). Проведенное исследование показывает, что опухоли толстой
кишки с мутантным типом гена K-ras более склонны
к лимфогенному метастазированию, чем опухоли с
«диким» типом, что косвенно свидетельствует о более агрессивном течении опухолевого процесса при
мутации гена. При наличии отдаленных метастазов
мутация гена K-ras была выявлена в трети наблюдений.
И.Г. Гатауллин и соавт. Клиническая оценка мутации гена K-ras у пациентов с колоректальным раком
87