диагностика
Учет результатов в режиме реального времени наиболее распространен в лабораториях , он дает возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения реакции . Поскольку кинетика накопления ампликонов напрямую коррелирует с числом копий исследуемой матрицы , возможна относительная и абсолютная количественная оценка ДНК или РНК в образце . Информация , полученная с помощью ПЦР в реальном времени , используется для мониторинга эффективности проводимой терапии , генотипирования , оценки клинического прогноза , исследования экспрессии генов и так далее .
— Каковы преимущества данного метода ? Какие моменты применения ПЦР можно причислить к его недостаткам ?
— К достоинствам ПЦР относятся : высокая чувствительность – 10 -12 – 10 -15 г / л ; высокая специфичность ; прямое определение аналита ; возможность исследования любого биоматериала ; допустимость одновременного выявления нескольких возбудителей в одной биопробе – мультиплексный анализ . Важными достоинствами метода является отсутствие накопления инфекционного агента , как это происходит в культуральных методах , а также простые требования к условиям хранения и транспортировке материала ; возможность проведения ретроспективной диагностики в архивном материале или биологических остатках .
Однако метод не лишен и недостатков : высокая чувствительность не всегда коррелирует с клинической информативностью ; выявляется не только живой возбудитель , но и фрагменты , « осколки » генома возбудителя после успешного лечения . Также возможность ошибок связана с изменчивостью инфекционных агентов в результате мутаций . Существенным недостатком метода является вероятность контаминации , что приводит к ложноположительному результату .
Могут встретиться два вида контаминации . Первый – то перекрестная контаминация от пробы к пробе в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси , приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов . С перекрестной контаминацией несложно справиться , пунктуально соблюдая технологию проведения реакции . Второй вид – контаминация продуктами амплификации , которая имеет наибольшее значение , так как в процессе полимеразной реакции ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации , что может приводить к тотальным ложноположительным реакциям . Чтобы свести к минимуму такую вероятность , необходима правильная организация и планировка помещений ПЦР-лаборатории , исключающая попадание ампликонов в пробирку с другим биологическим материалом и реамплификацию .
Гораздо реже возможны и ложноотрицательные результаты , связанные с наличием в исследуемой пробе ингибиторов реакции ( особенно в осадке мочи и гнойном отделяемом ). Ложноотрицательные результаты исключаются выбором оптимального протокола пробоподготовки , уничтожающим потенциальные ингибиторы реакции .
— Возможны ли ошибки при проведении диагностики методом ПЦР и с чем они могут быть связаны ?
— Ошибки при проведении ПЦР классифицируются на : ошибки преаналитического этапа , которые представляют наибольшую опасность в связи с невозможностью осуществить контроль во время проведения анализа . Они связаны с нарушением правил взятия , хранения и транспортировки биологического материала ; ошибки аналитического этапа возникают непосредственно в процессе работы в лаборатории и ошибки постаналитического этапа связаны с неверной интерпретацией врачом полученных результатов .
Наиболее частыми ошибками преаналитического этапа являются неправильный выбор места взятия биоматериала ( его необходимо забирать там , где предполагается локализация инфекционного процесса ). Также неправильная техника взятия биоматериала : исследуемый материал должен содержать максимальную концентрацию искомого инфекционного агента и не должен иметь нежелательных примесей , ингибирующих полимеразную реакцию . Ингибирующими примесями являются кровь , слизь , гной .
К ошибкам аналитического этапа относится неправильный выбор системы пробоподготовки , что приводит к сохранению в пробе ингибиторов ПЦР или потере нуклеиновых кислот . И в том , и в другом случае получается ложноотрицательный результат . Слабым местом амплификационных методов являются ошибки , связанные с контаминацией ампликонами . Эта проблема решается правильной планировкой помещений , организацией поточности в лаборатории и исключением возможности переноса ампликонов самими сотрудниками .
Ошибки на завершающем , постаналитическом этапе связаны с неверной интерпретацией врачом результатов ПЦР вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода .
— Каковы диагностические возможности ПЦР при тестировании на урогенитальные инфекции ?
— Хорошо известны амплификационные тесты диагностики инфекций , передающихся половым путем , накоплен большой опыт их применения . Тесты на хламидиоз , уреаплазмоз , микоплазмоз , гонорею и трихомониаз видоспецифичны , могут выполняться в качественном и количественном варианте и применяются для первичной диагностики заболевания , мониторинга лечения и подтверждения излеченности .
Вирусные заболевания урогенитального тракта стали диагностироваться сравнительно недавно : цитомегаловирусная , герпетическая ( в том числе специфическая диагностика I и II генотипов вируса простого герпеса ) и папилломавирусная ( также с генотипированием вируса ) инфекции . При необходимости проводится количественное определение вирусной нагрузки , что важно для мониторинга лечения . Ценной возможностью амплификационных методов является высоко специфическая диагностика урогенитального кандидоза , видовое типирование кандиды на albicans , glabrata , krusei , fungi и наличие количественного теста .
В последнее время востребованы тесты оценки биоценоза мочеполовой системы как у женщин , так и у мужчин с количественным определением нормальной , патологической и условно-патогенной микрофлоры ( гарднереллы , мобилункус , бактероиды , несколько видов стрептококков ). Диагностический интерес представляют мультипрайм-тесты , позволяющие проводить коамплификацию нескольких ДНК-матриц в одной пробирке и , таким образом , исследовать несколько инфекций , например герпес-комплекс – ВПГ- 1 / ВПГ-2 / ЦМВ ; TNK-комплекс – Trichomonas vaginalis /
38 Медицинский журнал « Дело Жизни »