Reacción de cadena de la polimerasa
Empleo: identificación/ detección de virus específicos o secuencias especificas de un gen.
La reacción de cadena de la polimerasa (PCR) un método in vitro de replicación de
ADN, es capaz de amplificar segmentos de ADN por más de un millón de veces. Una sola copia del genoma viral se amplía - si está presente en el material clínico produciendo millones de copias que pueden ser fácilmente detectadas por electroforesis.
Esto es logrado al crear una reacción mixta que, además de la muestra de ADN (conteniendo potencialmente el genoma blanco), contiene dos sondas de referencia de oligonucleótidos que complementan los extremos opuestos de cada cadena de la secuencia blanco, deoxinucleosidos trifosfatos y una polimerasa termoestable de ADN (polimerasa Taq).
La mezcla de reacción está entonces sujeta a un ciclo de temperatura con el fin de facilitar la replicación ADN y así aumentar la cantidad de ADN. Lo siguiente representa un ciclo típico:
• El primer paso del ciclo PCR es la desnaturalización de la muestra ADN mediante calentamiento de la mezcla de reacción a 95°C.
• Segundo, la mezcla es enfriada para permitir que los fragmentos se unan al ADN blanco.
• Tercero, la mezcla es calentada a 72°C para permitir la polimerización del ADN por la polimerasa Taq ADN. Se repite el ciclo de temperatura del PCR, típicamente 35 a 40 ciclos. De esta manera se pueden obtener más de un millón de copias del ADN.
Una vez completado el número de ciclos deseados, se separa el ADN blanco por electroforesis en gel y se analiza midiendo las bandas ADN o mediante la hibridación de Southern con sondas de referencia específicas.
En la actualidad se dispone comercialmente de cierto número de pruebas diagnosticas basadas en PCR. La PCR es aplicable al estudio de virus ARN si se emplea primero la transcriptasa reversa para hacer un cADN a partir del ARN blanco; denominado PCR transcriptasa reversa. Otras alternativas de PCR son la PCR "en tiempo real", la cual analiza simultáneamente las muestras espectrofotometricamente para visualizar la polimerización y la PCR anidada, la cual emplea un segundo equipo de sondas de referencia dentro de la región amplificada por el primer grupo. Cualquier técnica es útil cuando los niveles de ácido nucleico viral son bajos. La eficacia del PCR "en tiempo real" en diagnóstico clínico todavía tiene que ser establecido.
Según Carter et al. (2005).
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