efetividade da função da insulina nas células HepG2 . Para a insulina fresca , a quantidade de p-Akt1 , medida através da intensidade da banda da p-Akt1 no western blot , é proporcional à concentração de insulina aplicada às células HepG2 na gama de 0 a 300 nM ( Fig . 2A e painel superior de Fig . 2B ).
Figura 2 . ( A ) Quantidade relativa da cinase Akt1 fosforilada ( p-Akt1 – barras cinzentas ) e da Akt1 total ( barras brancas ) medidas por densitometria do “ western blot ” após tratamento da linha celular hepatica humana HepG2 com insulina . A proteína do citoesqueleto celular β-actina foi usada como controlo da quantidade de proteína carregada no gel de SDS-Page . A insulina foi usada fresca em diferentes concentrações ( nM ), sem ser submetida a abaixamento de temperatura , ou após armazenamento em condições isocóricas ( 300 nM de insulina ) durante 15 dias a -20 ° C na ausência e presença de 0.6M de sacarose . A quantidade relativa de Akt1 total foi usada como controlo biológico da homeostase celular ( é independente da concentração de insulina funcional ) e a quantidade de p-Akt1 depende da concentração de insulina funcional ( Kim et al ., 1999 ). A comparação das quantidades relativas de Akt1 e p-Akt1 assume 100 % para a condição 300 nM de insulina ( faixa 4 em ( B )). ( B ) “ Western blot ” para a deteção de p-Akt1 ( em cima ) e Akt1 total ( em baixo ), um dos 4 replicados usados para a quantificação e cálculo do desvio padrão apresentados no gráfico de barras em ( A ).
No western blot também se mediu os níveis da proteína β-actina do citoesqueleto celular . Sendo a β-actina uma proteína estrutural , a sua quantidade não varia com o estado metabólico da célula ( Fig . 2B ) e por isso pode ser usada como controlo para provar que a quantidade de proteína carregada no gel foi igual em todas as faixas do gel . Além disso , mediu-se ainda no western blot a quantidade total de Akt1 como indicador da homeostase celular ( estabilidade e equilíbrio necessário para a célula efetuar as suas funções ). A quantidade de Akt1 total não varia com a concentração de insulina aplicada às células , indicando que as células HepG2 estão saudáveis ( em homeostase ) nas várias condições estudadas ( Fig . 2A e painel inferior de Fig . 2B ). Sabendo que a quantidade de p-Akt1 reflete a função da insulina e que a quantidade total de Akt1 é um indicador da homeostase celular , avaliou-se o efeito do armazenamento em condições isocóricas a -20 ° C durante 15 dias na função da insulina . Testou-se o armazenamento da insulina em duas formulações diferentes , na ausência e presença de 0.6 M de sacarose , para demonstrar a utilidade do método isocórico na otimização das condições físicoquímicas de armazenamento num período de tempo aceitável para a indústria farmacêutica . A utilização do açúcar sacarose como composto que estabiliza a estrutura nativa das proteínas foi anteriormente descrita em várias publicações ( Baptista et al ., 2000 ; Melo et al ., 2010 ; Estrela et al ., 2015 ). O armazenamento da insulina em condições isocóricas a -20 ° C durante 15 dias resulta num decréscimo da função da insulina nas células HepG2 , medido através do decréscimo da quantidade de p-Akt1 ( barras cinzentas na Fig . 2A e western blot superior em Fig . 2B ). Este decréscimo é prevenido por adição de
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