Abstract — Optimization of protein formulations at subzero temperatures is required for many applications in the pharmaceutical industry , such as storage , transport and lyophilization . Using isochoric cooling ( constant volume ) is possible to reach subzero temperatures without freezing aqueous solutions . Protein damage is accelerated in liquid solutions compared to an ice matrix as diffusional and conformational freedom is still present leading to cold denaturation and eventually protein aggregation . Therefore , the use of isochoric cooling can be used to faster optimization of protein formulation in the pharmaceutical industry as demonstrated in this study for the peptide hormone insulin . Insulin damage ( loss of function ) after isochoric cooling to -20 ° C was evaluated through a signalling event elicited on human hepatocyte carcinoma cells showing a lost of 22 % of its function after 15 days . Formulation containing 0.6 M of the cryoprotectant sucrose prevented insulin damage .
Glossário
Arrefecimento isocórico também chamado de arrefecimento isovolumétrico porque ocorre em condição de volume constante Insulina hormona responsável pela redução da taxa de glucose no sangue ao promover a sua entrada nas células
Formulação de proteínas terapêuticas composição do meio onde as proteínas terapêuticas são armazenadas / administradas
Estrutura nativa de proteínas estrutura tridimensional de proteínas responsável pela sua função
Enzimas cinases tipo de enzima que transfere grupos fosfato entre moléculas
A produção e comercialização de proteínas terapêuticas requer o controlo da sua estabilidade , já que estas são submetidas a vários processos desde a produção até ao armazenamento e administração nos pacientes ( Cleland et al ., 1993 ). De facto , a otimização da formulação para o armazenamento , dosagem e administração de proteínas terapêuticas constitui um constrangimento importante no desenvolvimento de novos produtos proteicos por via biotecnológica ( Nayar e Manning , 2002 ). A insulina é uma das proteínas terapêuticas produzidas em maior escala . Esta atua como hormona responsável pela redução da taxa de glucose no sangue , promovendo a sua entrada nas células a partir do sangue ( Dagasan e Erbas , 2020 ). Devido à sua utilização terapêutica em pacientes diabéticos , o valor global anual do mercado de insulina aproxima-se dos 30 biliões de dólares . É produzida em grandes quantidades por técnicas de ADN ( ácido desoxirribonucleico ) recombinante pela indústria farmacêutica e é armazenada a temperaturas negativas por longos períodos ( Baeshen et al ., 2014 ).
Sendo a insulina uma proteína , a sua função depende da sua estrutura tridimensional , também chamada de estrutura nativa . A perda de estrutura nativa de uma proteína pode resultar do seu desenrolamento ( unfolding ), agregação , enrolamento incorreto ( misfolding ) e alterações químicas como a oxidação , entre outras ( Fersht , 2017 ). Quando a insulina perde a sua estrutura nativa durante o armazenamento , não consegue exercer a sua função quando administrada no organismo . Portanto , é fundamental otimizar as condições físico-químicas , isto é , o tipo de tampão , o valor de pH , a concentração de sal , a adição de compostos estabilizadores de proteínas , etc ., que permitem manter a estrutura nativa da insulina durante o seu armazenamento a temperaturas negativas . O problema que se coloca nesta otimização tem a ver com a dificuldade em testar o efeito das condições de armazenamento na estrutura nativa da insulina . Após congelamento , pode demorar meses ou mesmo anos até a insulina ou qualquer outra proteína terapêutica perder gradualmente a sua estrutura nativa e consequentemente a sua função ( Bhatnagar et al ., 2008 ). A seleção das condições ótimas de armazenamento pode assim demorar um período de tempo incompatível com as necessidades da indústria farmacêutica .
Neste artigo , demonstra-se a utilidade do método isocórico ( processo isocórico é aquele que ocorre a volume constante ) para acelerar o processo de perda de estrutura nativa da insulina a temperaturas negativas e deste modo poder otimizar , num período de tempo razoável , as condições físico-químicas que melhor preservam a estrutura nativa / função da insulina . O método isocórico permite testar o efeito de compostos crioprotetores na formulação de preparações de proteínas terapêuticas , exemplificado neste estudo para a insulina como modelo de proteína terapêutica .
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