Revista de Medicina Veterinaria e Investigación Revista Medicina Veterinaria e Investigación N°2 | Page 40

n = Zα 2 * p * q
incubación del anticuerpo primario durante toda
la noche a 8°C.
d2
El sistema de detección utilizado consistió en un
anticuerpo secundario de cabra biotinilado anti
fragmento Fc de ratón, incubación con el complejo
streptavidina-peroxidasa y revelado de peroxidasa
con diaminobencidina (DAB), de acuerdo al
siguiente protocolo ejecutado con posterioridad a
la microtomía:
n = (1.96)2*0.05*0.95
(0,18)2
n = 8
Donde:
n = Tamaño muestral : 8
•Desparafinación e hidratación de las muestras en
agua destilada.
Zα = Índice de seguridad (95%) : 1,96
p = Proporción esperada (0,05).
•Recuperación antigénica con calor en Olla digital
y buffer citrato a pH 6,0.
q = 1 – P (0,95).
d = Precisión (0,18).
•Bloqueo de la actividad pseudoperoxidásica por
medio de una solución acuosa de H2O2 al 3%.
En el estudio se incluyeron a potros que, sin
importar raza, edad y motivo, tuvieron indicación
médica de orquiectomía total bilateral.
•Lavado en buffer PBS pH 7,2 -7,6 y bloqueo de
proteína con solución diluente de anticuerpos.
Se excluyeron los potros criptorquidos bilaterales,
así como a aquellos que sólo presentaban un
testículo en el saco escrotal. •Incubación con anticuerpo primario de ratón
anti-calretinina (dilución 1:400), toda la noche a 4°
C. (Anexo 3)
Las muestras de testículos fueron obtenidas por
orquiectomía bilateral radical con el caballo de pie,
realizada por un profesional Médico Veterinario. •Lavado en buffer PBS.
•Incubación
con
anticuerpo
biotinilado por 30 minutos a TA.
Inmediatamente obtenidas las muestras, fueron
rotuladas con la información que identificaba al
paciente y almacenadas en contenedores plásticos
junto a bolsas de gel frío, para su transporte al
laboratorio de Histopatología de la Facultad de
Medicina Veterinaria de la Universidad San
Sebastián, Concepción, dónde se mantuvieron
refrigeradas a 8°C, hasta su procesamiento.
secundario
•Lavado en buffer.
•Incubación con el complejo streptavidina-
peroxidasa por 30 minutos a TA.
•Lavado en buffer.
•Incubación con solución de revelado para
peroxidasa a base de DAB.
Una vez en laboratorio, las muestras fueron fijadas
en formalina neutra al 10% e incluidas en parafina.
•Lavado en agua destilada.
•Contraste con Hematoxilina.
Al micrótomo se le realizaron cortes de hasta 3
micrones de espesor, los cuales fueron adheridos
a portaobjetos previamente silanizados. Las
muestras fueron secadas en estufa a 43°C por 24
horas.
•Deshidratado en alcohol etílico y montaje de los
preparados en resina sintética.
Con el fin de titular el anticuerpo primario a
utilizar, se confeccionó un micro arreglo de tejido
testicular (TMA) (anexo) pertenecientes a cuatro
especies distintas de mamíferos: gato, perro,
conejo y equino. Como control positivo se utilizó
parénquima testicular humano (correspondiente a
neoplasia testicular).
Con posterioridad, las muestras desparafinadas se
sometieron al protocolo de inmunodetección
“Detección
Estreptavidina-Peroxidasa”,
que
consideró la recuperación antigénica con buffer
citrato a pH 6.0, bloqueo de peroxidasa endógena
mediante una solución acuosa de peróxido de
hidrógeno al 3%, bloqueo de proteína con la
misma solución diluyente de anticuerpo e
Todos los datos del estudio referidos a
características zootécnicas de los animales
estudiados y presencia de células de Leydig en el
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