Introducción
La dermatofitosis , es una micosis superficial causada por un grupo de hongos llamados dermatofitos , capaces de degradar la queratina del estrato corneo de la piel , pelo y uñas ( Larrondo et al ., 2001 ; Martinez et al ., 2012 ). De éstos , Microsporum canis es la principal especie que ha sido aislada desde muestras clínicas de perros y gatos , tanto en Chile como en el mundo ( Silva et al ., 2003 ; Betancourt et al ., 2009 ; Murmu et al ., 2015 ; da Cunha et al ., 2019 ).
A pesar de la elevada prevalencia de estos hongos en animales domésticos , la investigación referida a su diagnóstico es escasa . Las metodologías comúnmente utilizadas para la detección a partir de una muestra clínica de pelos y escamas apuntan a técnicas convencionales , como el examen microscópico directo ( EMD ) realizado con hidróxido de potasio ( KOH ); donde los resultados están sujetos a la calidad de la muestra y experiencia del observador ( Gadea et al ., 2007 ; Levitt et al ., 2010 ), y por otro lado , el cultivo realizado en agar Sabouraud glucosa o agar selectivo DTM , que es una técnica en la que el crecimiento del hongo tarda alrededor de 3 semanas , pudiendo generar resultados falsos negativos cuando se utiliza un inóculo insuficiente o cuando el paciente ha estado sometido a terapia antimicótica previa ( Weinberg et al ., 2003 ; Putignani et al ., 2010 ). A diferencia de las muestras clínicas obtenidas desde humanos , las de animales están asociadas a una gran cantidad de agentes bióticos , lo que sumado al tiempo que se requiere para el crecimiento del hongo en cultivo , permite el desarrollo de otras especies fúngicas reportando así falsos positivos , en especial cuando no se conocen las características macro y micromorfológicas de los agentes dermatofitos ( Garcia & Ynaraja ., 1991 ).
Diferentes técnicas de biología molecular se han desarrollado en las últimas décadas para contar con un diagnóstico rápido de estas especies . Algunas de ellas han utilizado metodologías basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR ), PCR en tiempo real o PCR múltiple , entre otras ( Bergmans et al ., 2010 ; Alexander et al ., 2011 ; Berk et al ., 2011 ). Como diana de detección , se han utilizado los genes
8 de la quitina sintasa 1 ( CHS1 ) ( Kano et al ., 2000 ; Brillowska-Da̧browska et al ., 2007 ; Dabrowska et al ., 2014 ; Kobylak et al ., 2015 ), las regiones ITS1 del gen rDNA ( Brillowska-Dabrowska et al ., 2010 , 2013 ) y el gen de la topoisomerasa II ( Kanbe et al ., 2003 ; Luk et al ., 2012 ). Estos métodos detectan la presencia de diversos dermatofitos , por lo que la detección realizada con estos genes no es específica para identificar la presencia de M . canis .
Utilizando un modelo animal , Brouta y colaboradores determinaron que M . canis posee una metaloproteasa queratinolítica específica llamada MEP3 , la cual se expresa cuando hay infección cutánea en el hospedero causada por esta especie ( Brouta et al ., 2002 ). Dada la importancia de M . canis como agente causal de dermatofitosis en animales y su rol como agente zoonótico en Chile , en este trabajo desarrollamos un método rápido y específico para la detección de M . canis basado en la amplificación de DNA mediante PCR convencional , utilizando como diana la secuencia del gen MEP3 de M . canis . Además , realizamos la detección del gen MEP3 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa ( quantitative Polymerase Chain Reaction , qPCR ) desde muestras clínicas de pelos y muestras de cultivo positivas a M . canis , con el objetivo de proponer un método rápido y de alta sensibilidad para su detección .
Materiales Y Métodos Muestras
Se utilizaron 8 muestras de pelos provenientes de pacientes con sospecha clínica de dermatofitosis ( 6 perros y 2 gatos ) diagnosticadas mediante examen microscópico directo y cultivo . También se incluyeron 3 muestras de aislados positivos a M . canis , cultivadas en placas con agar Dermatophyte Test Medium ( BBL , USA ) e identificadas como positivas a M . canis mediante las características macro y microscópicas de la colonia . Tanto las muestras de pelos como las de cultivo , fueron facilitadas por el laboratorio clínico Vetlab ® ( Santiago , Chile ) durante el mes de junio del 2018 .