forma sexual Arthroderma otae , agrupándose en una rama diferente a las secuencias del gen Mep3 de dermatofitos del género Trichophyton y de metaloproteasas de hongos del género Aspergillus ( Figura 3 ). En conjunto , estos resultados indican que nuestras secuencias provienen de la amplificación específica del gen Mep3 de M . canis .
Discusión
El objetivo de este estudio fue diseñar un método de diagnóstico rápido , que detectara la presencia de M . canis en muestras clínicas provenientes desde el pelo de perros y gatos con sospecha clínica de dermatofitosis .
Las técnicas tradicionalmente utilizadas para el diagnóstico de dermatofitosis , tales como el examen microscópico directo ( EMD ) y cultivo ; poseen una sensibilidad diagnóstica de 73,3 % y 41,7 % respectivamente ( Levitt et al ., 2010 ). Si bien el EMD , realizado con hidróxido de potasio ( KOH ) es un método rápido , su precisión depende directamente de la experiencia del observador . Por otro lado , la identificación del agente causal mediante cultivo tarda aproximadamente 3 semanas y requiere de conocimiento calificado de las características macro y micromorfológicas de estos hongos , para una correcta identificación ( Weinberg et al ., 2003 ; Putignani et al ., 2010 ).
El método de diagnóstico descrito en este trabajo mostró ser específico para la identificación de M . canis a partir de muestras de pelo y cultivo , en un tiempo de 8 horas mediante PCR convencional ( PCR ) y de 6 horas utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa ( qPCR ); esto podría optimizarse , utilizando kits comerciales específicos para la extracción de DNA de hongos como Zymo Bacterial / Fungal DNA Mini Prep ( Zymo Research , Irvine , CA ) o Fungi / Yeast Genomic DNA Isolation Kit ( Norgen Biotek Corp , Ontario , Canada ) ( Kumar & Mugunthan , 2018 ; Vesty et al ., 2017 ) y así disminuir el tiempo de detección .
Para asegurar la sensibilidad en la detección del agente , elegimos la secuencia génica del gen MEP3 de
M . canis , la cual codifica para una metaloproteasa queratinolítica relacionada con la virulencia de esta especie ( Brouta et al ., 2002 ). Interesantemente , este gen está presente en otros dermatofitos del género Trichophyton , sin embargo , el diseño de los partidores utilizados en este estudio , se enfocó en una región que mediante BLAST reconociera la secuencia de M . canis con un 100 % de identidad , en comparación a otros organismos . Por lo que , estos partidores resultaron ser buenos candidatos para la identificación de esta especie , en contraste a otros trabajos que han utilizado regiones génicas que están presentes en más de una especie de dermatofito ( Brillowska-Dabrowska et al ., 2013 ; Dabrowska et al ., 2014 ).
En una primera instancia , diseñamos 2 pares de partidores específicos para la amplificación del gen MEP3 , utilizando la herramienta en línea Primer- BLAST de la NCBI ( Jian et al ., 2012 ). El primer par de partidores fue diseñado para PCR convencional y amplifica una región de 488 nucleótidos del gen MEP3 , mientras que el segundo par de partidores amplifica una región de 149 nucleótidos del gen MEP3 y fue diseñado para su utilización en PCR cuantitativo . Previamente otros autores realizaron la identificación de estos agentes , utilizando el gen de la quitina sintasa ( CHS1 ), sin embargo , este método detecta varias especies de dermatofitos , la mayoría pertenecientes a los géneros Microsporum y Trichophytom ( Kano et al ., 2000 ; Brillowska- Da̧browska et al ., 2007 ; Dabrowska et al ., 2014 ; Kobylak et al ., 2015 ). Si bien en todos estos trabajaros se utilizan muestras clínicas , dos de ellos realizaron la extracción de DNA a partir del cultivo microbiológico de la muestra , para lo cual hay que esperar al menos 15 días para obtener material biológico , alargando el tiempo de diagnóstico ( Brillowska-Da̧browska et al ., 2007 ; Kobylak et al ., 2015 ; da Cunha et al ., 2019 ).
Igualmente , otros grupos , han utilizado genes de la secuencia ITS1 del ADN ribosomal de estos hongos , realizando el diagnóstico a nivel de género , no logrando identificar las especies M . canis y M . audonii ( Brillowska-Dabrowska et al ., 2010 , 2013 ). Para validar nuestros resultados respecto al de otros
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