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ANÁLISIS FUNCIONAL DE FACTORES MOLECULARES QUE CONTROLAN GENES
INVOLUCRADOS EN LA SÍNTESIS DE FASEOLOTOXINA EN Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola, AGENTE CAUSAL DEL TIZÓN DE HALO DEL FRIJOL
(Phaseolus vulgaris L.)
Presenta: M.C. Yazmin Lizeth Guardado Valdivia
Director: Dra. Selene Aguilera Aguirre
Co-Director: Dr. Jesús Murillo Martínez
Fecha: 13 de Diciembre del 2018 Doctorado en Ciencias en Alimentos
Seminario de Avance
Nayarit ocupa el segundo lugar de producción de frijol; sin embargo, el tizón de halo, cuyo agente causal
es Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, genera pérdidas hasta del 43% de la producción. Se ha
reportado que la faseolotoxina potencia esta enfermedad, ya que afecta la ruta de síntesis de arginina, por
lo que inhibe el crecimiento vegetal 1 . Se ha determinado una región cromosómica, denominada Pht, que
contiene genes involucrados en la síntesis de dicha toxina 2 ; adicionalmente se ha descrito que el sistema
de dos componentes GacS/GacA controla la expresión de diversos factores de patogenicidad y virulencia,
entre ellos la síntesis de faseolotoxina 3 . Actualmente es escasa la información sobre la regulación de la
síntesis de faseolotoxina que permita plantear un modelo que explique cómo esta bacteria coordina la
producción de esta toxina, de manera dependiente de la temperatura. De acuerdo con esto, se plantearon
estudios enfocados en determinar la participación de genes relacionados con el sistema GacS/GacA, que
participen en la regulación de la síntesis de faseolotoxina en esta bacteria fitopatógena que afecta cultivos
de interés agroalimentario.
El objetivo de esta investigación es analizar el efecto de los reguladores transcripcionales HrpRS, RpoN,
RpoS, HrpL, RsmA e IHFA relacionados con el sistema GacS/GacA, sobre la transcripción de genes
involucrados en la síntesis de faseolotoxina.
Para analizar el efecto de los reguladores transcripcionales, la estrategia inicial fue generar mutaciones en
los genes a evaluar. Para esto, se llevaron a cabo dichas mutaciones en los genes reguladores. Se extrajo
DNA cromosómico de P. syringae pv. phaseolicola, se diseñaron oligonucleótidos para amplificar
fragmentos internos de los reguladores transcripcionales y se realizaron amplificaciones mediante PCR.
Para la obtención de las mutantes, los fragmentos internos amplificados se clonaron en el vector
pCR4®Blunt TOPO (Invitrogen®). Para verificar las construcciones, se realizaron reacciones de restricción
y PCR. Posteriormente, se transformaron células competentes de P. syringae pv. phaseolicola con la
construcción mediante electroporación y a través de eventos de recombinación se obtuvieron las mutantes
regulatorias. Para verificar que la mutación se llevó a cabo de manera específica en el gen de interés, se
realizaron PCR utilizando el DNA cromosómico de las mutantes. Por otra parte, para evaluar el efecto de
la sobreexpresión de los genes reguladores, se obtuvieron cepas sobreexpresantes de los genes
reguladores. Para esto, los genes reguladores fueron amplificados mediante PCR y se clonaron en el vector
pUCP20. Una vez verificadas las construcciones, se introdujeron a células competentes de P. syringae pv.
phaseolicola. Se evaluó el efecto de las mutaciones y sobreexpresiones sobre la producción de
faseolotoxina, para lo cual cultivos de las cepas fueron crecidos bajo condiciones de síntesis de la toxina.
De esta manera, se obtuvieron los sobrenadantes bacterianos de las cepas incubadas a 18 y 28 °C y se
analizó su efecto sobre el crecimiento de células de Escherichia coli JM103.
Resultados obtenidos mediante eventos de recombinación, permitieron obtener cepas mutantes afectadas
en genes que codifican para los reguladores transcripcionales HrpRS, RpoN, RpoS, HrpL e IHFA
relacionados con el sistema GacS/GacA de P. syringae pv. phaseolicola. Adicionalmente, se obtuvieron las
cepas sobreexpresantes, las cuales poseen un plásmido de múltiples copias que contiene clonado genes
reguladores. Como resultado de las mutaciones y sobreexpresiones, las cepas modificadas genéticamente
fueron incapaces de producir faseolotoxina.
Se concluye que los genes hrpRS, rpoN, rpoS, hrpL e ihfA son esenciales para controlar la síntesis de la
faseolotoxina en P. syringae pv. phaseolicola NPS3121.
1. Mitchell, R., Bieleski, R. (1977). Involvement of phaseolotoxin in halo blight of beans. Transport and conversion to functional toxin. Plant
physiol. 60, 723-729.
2. Aguilera, S., López, K., Nieto, Y., Garcidueñas, R., Hernández, G., Hernández, J., Murillo, J., Álvarez, A. (2007). Functional Characterization
of the Gene Cluster from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola NPS3121 Involved in Synthesis of Phaseolotoxin. Journal of Bacteriology,
189(7), 2834–2843.
3. De la Torre, S., Aguilera, S., Ibarra, E., Hernández, J., Hernández, A., Murillo, J., Álvarez, A. (2011). Gene expression of Pht cluster genes
and a putative non-ribosomal peptide synthetase required for phaseolotoxin production is regulated by GacS/GacA in Pseudomonas syringae
pv .phaseolicola. Research in Microbiology, 162, 488–498.