本章概述了目前人血白蛋白的生产过程 , 以及白蛋白制剂的安全性
Connie Broumis 全球病原体安全部 , CSL Behring , 澳大利亚
Wilfried Freudenberg 生产总监 , CSL Behring
Philipp Schumann 工艺流程部 , CSL Behring AG , 伯尔尼 , 瑞士
* 文章修改自 Lenz K , Kramer ( eds ) 《肝脏疾病 中的白蛋白代谢异常》 ; UNI-MED Science , 2014 年第 1 版 ( ISBN 978-3-8374-1417-2 ) 并已获得授权
人血白蛋白成功用于补充血容量治疗和许多其他
适应证已逾 60 年 , 其用量远大于其他生物制品 , 并且年消耗量仍在持续增加 。 从上世纪 70 年代到 90 年 代进行了很多有关人血白蛋白的研究 , 当时出现的副作 用与早期白蛋白和血浆蛋白制剂中含有的杂质有关 。 不 过自那以后制造工艺已大幅提高并不断发展 。 当今生产 的高纯度白蛋白已显示出优异的长期安全性 。
生产质量的目标
生产商希望生产高纯度治疗性人血白蛋白制剂 , 使 其中的白蛋白尽可能接近天然的血浆蛋白 。 治疗性白蛋 白应该是单体 , 不能够含有聚合物 , 因为后者会影响患 者对药物的耐受性 。 耐受性的产生也可能是因为其他血 浆蛋白因巴氏灭菌 ( 60 ℃ 热处理 10 小时 ) 而发生结构 改变 , 进而造成潜在的不良反应 。
老一代白蛋白产品使用经验表明 , 高水平的前激肽 释放酶激活剂 ( PKA ) 会引起低血压 , 高水平的内毒素则 与发热有关 , 应予以避免 。 金属离子特别是铝离子 , 应 该控制在非常低的水平 , 以免在肾功能受损患者或新生 儿体内蓄积 。
当代白蛋白的生产过程
白蛋白的制备源于混合的人血浆 , 其中总蛋白的含 量约为 60g / L 。 血浆中白蛋白的浓度约为 40g / L , 是其 中含量最高的蛋白质 。 与其他主要的血浆蛋白相比 , 白 蛋白的溶解度很高而等电点 ( 当分子不带任何净电荷时 的 pH 值 ) 较低 。 此外 , 沿白蛋白多肽链的 17 个二硫键 赋予其结构的稳定性 , 当其他蛋白可能变性时 , 白蛋白 仍处于天然状态 。 这些独特的特性使白蛋白可以通过相 对简单但有效的分馏方法进行纯化 。
改变 pH 值 、 温度和 / 或中间体的离子强度 , 通常 可使可溶性蛋白沉淀 , 并通过离心或过滤除去 , 可从而 实现血浆蛋白的分离或分馏 。
一种沉淀蛋白的有效方法是往血浆池中加入乙醇 , 同时冷却 ( 乙醇冷分馏 ), 这一工艺由 Edwin Cohn 于
1946 年发明 , 专门用于白蛋白的纯化
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。 对该工艺的改
良包括乙醇浓度从 0 % 逐渐增加到大约 40 %, 以及将 pH 值从中性降到 4.8 左右 ( 约等于白蛋白的等电点 ) 。 在每一个阶段 , 可通过离心或过滤技术回收沉淀出来的 有价值的蛋白质如免疫球蛋白及 α1- 蛋白酶抑制剂 。
大多数的制造商仍按照最初的 Cohn 法生产白蛋 白 , 或者是改良的 Cohn 法 ⸺ Cohn-Oncley 法 ( 其中 乙醇浓度梯度可达到 43 %) 。
另外还有一个同样有效的乙醇分馏方法是基于 Kistler 和 Nitschmann 在 1962 年发明的工艺
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, 该工 艺较少使用沉淀步骤 , 沉淀出蛋白质通过过滤或离心去 除 。
当前白蛋白产品的生产过程及安全性
一些蛋白纯化工艺 , 第一步都是除去含有凝血因子 的冷沉淀馏分 。 由此产生的乏冷沉淀血浆可以通过层析 树脂来吸附 IX 因子 、 X 因子 、 凝血酶原复合物和 C1 抑 制剂 。 对 Cohn 法或改良的 Cohn 法来说 , 紧接着是用 8 % 乙醇沉淀 , 沉淀 ( 馏分 1 ) 中含有的凝血因子 X Ⅲ , 可 以被专用树脂从上清液中所吸附分离 。
为进一步用乙醇沉淀分离免疫球蛋白 ( 馏分 II 和 Ⅲ 或沉淀物 A ), Cohn 法使用浓度 25 % 、 pH 值为 6.9 的乙 醇 , 而 Kistler 和 Nitschmann 法则采用浓度 19 % 、 pH 值约为 5.9 的乙醇 。 溶液中含有白蛋白 , 当乙醇浓度增 至约 40 % 时 , α1- 蛋白酶抑制剂和转铁蛋白 ( 馏分 Ⅳ ) 被进一步沉淀析出 。 最后 , 随着乙醇浓度略微増加 , 白 蛋白在溶液 pH 值接近其等电点时沉淀 。 乙醇沉淀的所 有步骤均是在 0 ℃ 以下进行的 。 所得溶液馏分 Ⅴ 或沉淀 C 含有纯化的白蛋白 。 经过超滤和巴氏灭菌 ( 60 ℃ 热处 理 10 小时 ), 灭活可能存在原料中的残余病毒 , 最后进 行灌装 。
加入稳定剂可以确保白蛋白在加热时不致发生变性 或沉淀 , 如果没有这些稳定剂 , 在最终的容器中就会出 现高浓度的多聚体和聚合物 。
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