Pronto se evidenciaría que los daños cerebrales se presumían irreparables.
En los años previos a aquella caída, Don Carlos vivió su periodo más feliz en la Universidad de Alcalá de Henares, donde estudió junto a su tío, Don Juan de Austria y Alejandro Farnesio, que contaban prácticamente su misma edad
Sin destacar en los estudios, sino todo lo contrario, el hijo del Rey al menos se contagió del ambiente juvenil y saludable del lugar.
El Príncipecipe heredero se crió lejos de sus padres. Huérfano de madre a los cuatro días de nacer, Carlos quedó bajo la custodia de sus tías, las hijas de Carlos V que todavía no tenían compromisos matrimoniales, puesto que su padre estuvo ausente de España en los primeros años de su reinado. Con 11 años, una plaga de malaria asoló la Corte y afectó al joven, quizás más vulnerable que el resto por sus deficientes genes. La enfermedad provocó en el Príncipe un desarrollo físico anómalo en sus piernas y en su columna vertebral, que, a su vez, pudo estar detrás de la grave caída que sufrió a los 18 años de edad mientras perseguía por el palacio a una cortesana. Los médicos llegaron a desahuciar al joven, dándole apenas cuatro horas de vida, y un grupo de franciscanos trasladaron los huesos de San Diego de Alcalá a los pies de su cama.
Contra todo pronóstico, una arriesgada trepanación pudo salvar la vida del Príncipe Carlos.